Sviluppo di un modello murino umanizzato con cellule epatiche umane e cellule immunitarie

Abstract

Fonte: Dagur, R. S. et al., Istituzione del modello murino TK-NOG umanizzato duale per la patogenesi epatica associata all'HIV.J. Vis. Exp.(2019)

Questo video dimostra un metodo per generare un modello murino umanizzato duale con un sistema immunitario umano e cellule epatiche. Comporta il trapianto di cellule epatiche umane e cellule staminali e progenitrici ematopoietiche in un topo immunodeficiente transgenico tramite iniezione intrasplenica, portando all'attecchimento delle cellule epatiche e allo sviluppo di cellule immunitarie umane.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Lavorazione del sangue del cordone ombelicale e isolamento delle cellule staminali/progenitrici ematopoietiche umane (HSPC)

1. Eseguire tutte le fasi del protocollo in condizioni sterili in cappe a flusso laminare.
2. Prelevare il sangue del cordone ombelicale (CB) raccolto in provette eparinizzate e portare il volume fino a 35 ml aggiungendo soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS). Sovrapporre il campione sopra il mezzo di separazione dei linfociti (LSM) come illustrato nella Figura 1 e centrifugare l'LSM con il CB stratificato a 400 x g per 35 minuti a 4 °C senza freni.
   nota: Diluire il sangue con cura e delicatezza per evitare che si mescoli all'interfaccia.
3. Rimuovere con cura lo strato superiore di LSM e plasma e trasferire l'interfaccia del buffy coat bianco in una nuova provetta utilizzando una pipetta di trasferimento.
4. Risospendere il buffy coat in 30 - 40 mL di tampone ghiacciato (PBS + 0,5% di albumina sierica bovina [BSA] + 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico [EDTA]). Utilizzando una pipetta, combinare 20 μl della sospensione cellulare con 20 μl di blu di tripano allo 0,4% e pipettare 10 μl della miscela nell'apertura esterna di una delle due camere di un vetrino di conteggio e inserire il vetrino in un contatore di cellule automatizzato per contare le cellule.
   nota: Usa un tampone ghiacciato in tutti i passaggi, poiché aiuta a mantenere le cellule vitali.
5. Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a 4 °C e aspirare accuratamente il surnatante. Quindi, aggiungere 300 μl di tampone ghiacciato.
6. Aggiungere 100 μl di reagente bloccante il recettore Fc umano e 100 μl di microsfere coniugate con anticorpi CD34 monoclonali di topo anti-umano per un massimo di 1 x 10⁸ cellule (vedere la Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a 4 °C, aggiungere 10 mL di tampone ghiacciato per lavare le cellule e centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C.
   NOTA: Aumentare le dimensioni in base al numero di celle se sono presenti più di 1 x 10⁸ celle.
7. Rimuovere con cautela il surnatante, risospendere il pellet in 500 μL di tampone e procedere con la fase di separazione magnetica per arricchire gli HSPC.
8. Posizionare una colonna LS a selezione positiva (vedere la Tabella dei materiali) nel campo di smistamento delle cellule attivate magneticamente e farla passare con 3 mL di tampone.
9. Caricare il campione sulla colonna LS in grado di intrappolare le microsfere legate al CD34+ umano nei campioni e lasciarlo fluire sotto l'influenza della gravità nella provetta di raccolta.
10. Lavare la colonna 3 volte con tampone e raccogliere l'eluito nella stessa provetta di raccolta della frazione di cellule CD34^-.
11. Immergere la colonna con 5 mL di tampone per eluire le cellule CD34⁺ in una nuova provetta di raccolta. Ripetere la procedura per ottenere una purezza del >90%.
12. Contare le cellule CD34⁺ eluite utilizzando il colorante blu di tripano in un emocitometro. Dopo il conteggio, centrifugare le cellule CD34⁺ a 300 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
13. Risospendere le cellule CD34⁺ in 25 μL di PBS per un'iniezione da utilizzare immediatamente nel trapianto o crioconservare le cellule a una concentrazione di 1-2 milioni/mL in terreno di congelamento (terreno del Roswell Park Memorial Institute [terreno RPMI 1640] + 50% siero fetale bovino (FBS) + 10% dimetilsolfossido [DMSO]) per un ulteriore utilizzo nei trapianti.
    nota: Conta sempre le cellule vitali prima di utilizzarle nel trapianto.
14. Per verificare la purezza dell'eluito CD34⁺, prelevare 50 μL della sospensione e incubarla con 10 μL di ficoeritrina o anticorpo CD34 umano coniugato con PE per 30 minuti a 4 °C. Dopo l'incubazione degli anticorpi, lavare le cellule colorate con PBS, risospenderle in 100 μL di PBS, quindi procedere con l'esecuzione della citometria a flusso. Aggiungere un'ulteriore provetta di cellule senza anticorpi per progettare il cancello nel citometro a flusso.
15. Dopo l'acquisizione, analizzare i dati selezionando la regione di interesse su un grafico a dispersione diretta (FSC) e a dispersione laterale (SSC), seguito dal gating per singole celle su grafici di area FSC e altezza FSC. Cellule CD34-positive al gate su singole cellule nel canale PE e grafico dell'area SSC.

2. Preparazione di epatociti umani (HEP) per il trapianto

1. Rimuovere gli epatociti crioconservati dall'azoto liquido, immergere rapidamente la fiala nel bagnomaria e scongelare per circa 90 - 120 s.
2. Rimuovere il tappo del flaconcino e versare gli epatociti scongelati nella provetta conica da 50 mL del mezzo di scongelamento riscaldato.
3. Sospendere le cellule facendo oscillare manualmente la provetta da 50 ml per alcuni secondi.
   nota: Non agitare il tubo.
4. Pellettare le celle a 100 x g per 8 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle pellettate in PBS con BSA allo 0,1% e raggrupparle con HSPC fresche o scongelate (rapporto 10:1) in PBS in un volume finale di 80 μL/topo.

3. Manipolazione degli animali, screening, genotipizzazione e trattamento per HSPC umano e trapianto di epatociti

1. Movimentazione degli animali
   1. Come risultato di una grave immunodeficienza, allevare, allevare e maneggiare topi TK-NOG in condizioni asettiche.
   2. Indossare sempre un camice da laboratorio, guanti, copriscarpe e una maschera facciale per prevenire l'infezione da microrganismi potenzialmente patogeni.
   3. Utilizzare guanti e strumenti sterili per l'intervento chirurgico e maneggiare gli animali in modo asettico durante l'intervento.
2. Selezione dei topi TK-NOG per l'esperimento
   1. Mantenere la colonia di ceppi TK-NOG allevando topi TK-NOG femmine con cucciolate maschi non TK-NOG e selezionare la prole transgenica mediante genotipizzazione.
      nota: Eseguire la genotipizzazione (vedere passaggio 3.3) per determinare la presenza o l'assenza del transgene nei topi maschi e femmine appena nati al momento dello svezzamento.
   2. Selezionare i maschi a 6-8 settimane di età per il trapianto a causa della loro elevata sensibilità alla deplezione mediata da GCV degli epatociti che esprimono il transgene HSV-TK.
   3. Marcare i topi al momento dello svezzamento o dell'intervento chirurgico per facilitarne l'identificazione. Annotare il peso e lo stato di salute degli animali.
3. Genotipizzazione per la presenza del transgene HSV-TK mediante reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale
   1. Eseguire la genotipizzazione al momento dello svezzamento (di solito a 3 - 4 settimane di età). Per la genotipizzazione, tagliare un pezzo dell'orecchio di topo in una cabina di sicurezza biologica a flusso laminare per mantenere la sterilità ed estrarre il DNA genomico utilizzando un kit di isolamento del DNA genomico.
   2. Amplificare il DNA genomico estratto dall'auricolare in una miscela di reazione da 20 μL per lo screening del transgene HSV-TK sotto il controllo del promotore dell'albumina umana aggiungendo 1 μL di primer diretto 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL di primer inverso 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL di sonda FAM 5'-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', e 10 μL di master mix su uno strumento di reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale.
   3. Impostare le impostazioni della PCR in tempo reale come segue: 60 °C per 30 s (fase di prelettura), 95 °C per 10 min (fase di mantenimento), 40 cicli di 95 °C per 15 s e 60 °C per 1 min (fase PCR) e 60 °C per 30 s (fase di post-lettura).
      nota: Un ciclo di soglia (Ct) inferiore a 22 è considerato positivo per il transgene HSV-TK.
4. Trattamento con ganciclovir e treosulfan
   1. Utilizzando un ago da 27 G, iniettare nei topi TK-NOG iniezioni intraperitoneali di GCV (6 mg/kg) 2 volte al giorno al giorno 7 e al giorno 5 in 100 μL di soluzione salina prima dell'intervento chirurgico per esaurire le cellule parenchimali transgeniche dei topi (come mostrato nella strategia sperimentale nella Figura 2).
   2. Nei giorni 3, 2 e 1 prima dell'intervento, precondizionare i topi con dosi intraperitoneali non mieloablative di treosulfan (1,5 g/kg/die) in 100 μL di soluzione fisiologica, utilizzando un ago da 27 G.
   3. Un giorno prima dell'intervento, prelevare due o tre gocce (~100 μL) di sangue dalla vena sottomandibolare pungendola con una lancetta da 5 mm e isolare il siero mediante centrifugazione (1.500 x g per 10 minuti a 4 °C) per il test dell'alanina aminotransferasi (ALT) per valutare il grado di danno epatico.
5. Preparazione per l'intervento chirurgico
   1. Usa le tosatrici per radere il pelo del topo che circonda il sito dell'incisione (a sinistra della parete peritoneale) prima dell'intervento chirurgico.
   2. Regolare il flusso di ossigeno a 1 L/min e il flusso di isoflurano al 3% - 5% in una camera di induzione utilizzando una macchina per anestesia per topi. Posizionare un topo alla volta nella camera di induzione per l'anestesia.
   3. Collegare un'estremità di un tubo di prolunga sterile (con una capacità di tenuta di 550 μL di sospensione; vedere la Tabella dei materiali per le specifiche) a un ago da 30 G e l'altra estremità a una siringa da 1 mL.
   4. Riempire la siringa con la sospensione (80 μL/topo) di HEP e HSPC raggruppati (vedere paragrafo 2), inserire la siringa nella tacca di una pipetta a dosaggio ripetitivo e regolare l'erogatore in modo che eroga 10 μL ad ogni pressione.
   5. Una volta che i topi sono anestetizzati (di solito dopo 3-4 minuti), passare il flusso di isoflurano al cono del naso e ridurre la velocità di flusso di isoflurano al 2% - 3%.
6. Trapianto intrasplenico di HSPC ed epatociti umani nei topi
   1. Eseguire tutte le fasi dell'intervento chirurgico in una cabina a flusso laminare in condizioni sterili.
   2. Posizionare un telo sterile pulito sulla superficie di lavoro e strofinare il lato sinistro del corpo di ciascun topo con il 10 % di iodio povidone seguito da alcol isopropilico al 70 %, prima di praticare un'incisione.
   3. Praticare una piccola incisione (~1 - 1,5 cm di lunghezza e 5 mm di profondità) nella pelle, nel muscolo e nel peritoneo a sinistra della parete peritoneale con le forbici del tipo di Vanna per entrare nella cavità peritoneale a circa 5 mm sotto il bordo inferiore della gabbia toracica.
   4. Individuare la milza, tirarla leggermente con una pinza verso l'area operativa per un facile accesso e inserire l'ago da 30 G nell'asta inferiore della milza.
   5. Sbloccare lo stantuffo della pipetta di dispensazione ed erogare 10 μl di volume alla volta, con un limite di 60-80 μl per milza. Ritrarre lentamente l'ago e tagliare la milza con clip di legatura utilizzando un applicatore di legatura.
   6. Reinserire la milza nella cavità corporea con applicatori a punta di cotone inumiditi con PBS sterile.
   7. Chiudere lo strato muscolare della parete addominale utilizzando un modello di sutura interrotto riassorbibile (non continuo). Realizza la chiusura della pelle con un modello di sutura interrotto utilizzando suture non assorbibili.

Results

Figura 1: Schema dell'arricchimento delle cellule CD34⁺ dal sangue del cordone ombelicale.(A) Il sangue del cordone ombelicale viene stratificato su un terreno di separazione dei linfociti (LSM) e centrifugato per isolare il buffy coat. (B) Le colonne LS vengono posizionate su un supporto magnetico e risciacquate con un tampone BSA, quindi con l'aggiunta d...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aghi da 27G1/2"	BD bioscienze	305109
Aghi 30G1/2"	BD bioscienze	305106
Provetta da 5 mL in polistirene a fondo tondo 12 x 75 mm	Corning	352054
BD 1 mL Siringa per tubercolina senza ago	BD bioscienze	309659
Bioanalizzatore array BD FACS	BD Bioscienze		Per il controllo della purezza delle cellule CD34+ eluite
Software array BD FACS	BD Bioscienze		Software per l'analisi delle cellule CD34+ acquisite su array FACS
Soluzione di lisi BD FACS	BD Bioscienze	349202	Per lisare i globuli rossi
BD LSR II	BD Bioscienze		Strumento per l'acquisizione di campioni di citometria a flusso
BD Vacutainer Provetta in plastica per la raccolta del sangue	BD bioscienze	BD 367874	Per raccogliere il sangue del cordone ombelicale
Albumina sierica bovina	Sigma-aldrich	Codice: A9576
Kit CD34 MicroBeads, umano	Miltenyi Biotec	Codice 130-046-702	Per l'isoizzazione di CD34+ HSPC
CD34-PE, umano	Miltenyi Biotec	Codice 130-081-002	Anticorpo utilizzato per il controllo della purezza delle cellule CD34+ eluite
Vetrini per conteggio cellulare	Bio-rad	1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Kit Tessuto	Thermofisher scientifico	CS11204	Per l'estrazione del DNA genomico dall'auricolare
Applicatori con punta in cotone	Mckesson	24-106-2S
DMSO (dimetilsolfossido)	Sigma-aldrich	D2650-5X5ML
Set di estensione Microbore Slide Clamp(s) Maschio fisso Luer Lock. L: 60 in L: 152 cm PV: 0,55 mL Percorso del fluido Sterile	BD bioscienze	Telefono 30914	Collegato al pippet di erogazione e al carico con sospensione HSPC e HEP
FACS Diva versione 6	BD Bioscienze		Software del citometro a flusso necessario per l'acquisizione del campione
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	10438026
Software di analisi FLOWJO v10.2	FLOWJO, LLC		Software di analisi per citometria a flusso
Ganciclovir	APP Pharmaceuticals, Inc.	Codice 315110	Farmaco per la prescrizione
Provette Greiner MiniCollect EDTA	Greiner bio-one	450475
Terreno di scongelamento degli epatociti	Laboratori di ricerca del triangolo	MCHT50
Applicatori di clip per legatura aperta Horizon	Teleflex	537061	Per tenere le clip di legatura
Epatocita umano	Laboratori di ricerca del triangolo	HUCP1	Epatociti umani crioconservati, qualificati per induzione
Forbici per iride, dritte	Ted Pella, Inc.	Codice 13295
bisturi	Punto MEDIO	Verga d'oro 5 mm
Colonne LS	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-401	Utilizzato per intrappolare le microsfere CD34+ (selezione positiva)
Mezzo di separazione dei linfociti (LSM)	MP Biomedicali	Codice: 50494	Per l'isolazione di linfociti dal sangue periferico
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	Codice 130-042-303	Contiene il separatore MACS Qudro e le colonne LS
Forbici a molla per micro dissezione McPherson-Vannas	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5605	Utilizzato per praticare un'incisione sulla pelle per esporre la milza
Pinze per microdissezione	Roboz Surgical Instrument Co.	RS-5157	Per trattenere ed estrarre la milza dalla cavità peritoneale
Mouse CD45-FITC	BD Bioscienze	Codice: 553080	Specifico per il mouse
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Clone	SH30256.02
Separatore Qudro MACS	Miltenyi Biotec	Codice 130-090-976	contiene quattro colonne LS
RPMI 1640 medio	Gibco	11875093
PCR in tempo reale StepOne Plus	Biosistemi Applicati		Strumento utilizzato per la genotipizzazione
Pipetta a dosaggio ripetitivo serie Stepper da 1 ml	DYMAX CORP	T15469	Utilizzato per erogare la sospensione HSPC e HEP in modo controllato
TaqMan Mix principale di espressione genica	Thermofisher scientifico	4369016
Contatore di celle automatizzato TC20	Bio-rad	1450102
Topi TK-NOG			Fornito dall'Istituto Centrale per gli Animali da Sperimentazione (CIEA, Giappone; Dott. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu)
Treosulfan	Medac GmbH		Fornito da Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH)
Tripan Blu	Bio-rad	1450022
Micro forbici tipo Vannas, dritte, 80 mm L	Ted Pella, Inc.	Anno 1346	Utilizzato per praticare un'incisione sulla pelle per esporre la milza
Clip di legatura tradizionali in titanio Weck hemoclip	Suture	Codice: 523700	Legare la milza dopo l'iniezione