1. Generazione e convalida di anticorpi Fab a catena singola (scFab)-CAR.
NOTA: Le CAR contengono tipicamente 3 domini critici: un dominio di targeting dell'antigene, un dominio spaziatore/transmembrana e un dominio di segnalazione citoplasmatica. La progettazione precisa di ciascun CAR dipende dall'obiettivo previsto e quindi, a parte le caratteristiche chiave del costrutto rilevanti per la generazione del retrovirus, non saranno descritte in dettaglio in questo protocollo. Il disegno generale delle RCA utilizzate per gli studi descritti di seguito è illustrato nella Figura 1. In breve, il dominio di targeting comprende l'intera catena leggera e il dominio variabile e CH1 della catena pesante dall'anticorpo monoclonale genitore legato da un linker semirigido. Il dominio spaziatore/transmembrana proviene dal topo CD28 e il dominio di segnalazione è una fusione contenente elementi del topo CD28, CD137 (4-1BB) e CD247 (CD3ζ). Questi elementi sono assemblati mediante procedure standard di biologia molecolare come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la sintesi di un "blocco genico" appropriato. I dettagli sulla generazione del mAB287 CAR sono contenuti in Zhang et al. Le sequenze di cDNA possono essere ottenute dagli autori su richiesta.
- Assemblaggio del costrutto CAR
- Sintetizzare separatamente l'anticorpo Fab a catena singola (scFab) e i domini di spaziatore/segnalazione combinati e utilizzare una tecnica di legatura a "3 punti" per assemblare il costrutto finale (Figura 1).
NOTA: Il requisito chiave per l'inserto CAR è che contenga siti endonucleasici di restrizione fiancheggiante che consentano la legatura nel vettore di espressione retrovirale pMSCV-IRES-GFP II (pMIG II), o un derivato correlato.
- Validazione dell'espressione superficiale CAR
- Trasdurre le cellule di ibridoma utilizzando particelle retrovirali derivate da pMIG II generate da un protocollo standard (ad esempio, Holst et al.).
- Eseguire l'analisi di citometria a flusso per rilevare l'espressione di GFP dal vettore CAR.
- Espressione della superficie di colorazione del CAR degli ibridomi trasdotti utilizzando anticorpi marcati contro la catena κ del topo (ad esempio, clone RMK-45).
- Convalida della specificità CAR
- Stimolare le cellule di ibridoma trasdotte con opportuni antigeni cellulari o legati alla piastra. Dopo una co-coltura notturna, raccogliere i surnatanti e le citochine secrete e analizzarli mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA).
NOTA: Idealmente, ogni CAR dovrebbe essere convalidato in modo indipendente prima di essere utilizzato per la trasduzione. In questo passaggio, l'esperimento può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento.
2. Trasfezione di cellule produttrici virali (dal giorno - 4 al giorno 3)
NOTA: Il retrovirus viene prodotto utilizzando cellule Phoenix-ECO (vedi la Tabella dei Materiali). Utilizzare precauzioni appropriate per la generazione di agenti potenzialmente infettivi (preferibilmente includendo un armadio designato di livello di biosicurezza 2 (BSL-2) e un incubatore separato per la coltura di cellule trasfettate/trasdotte).
- Scongelamento delle celle di Phoenix (giorno -4)
- Scongelare 2 x 106 celle Phoenix-Eco. Aumentare il numero di celle Phoenix se sono pianificate più trasduzioni.
- Piastrerli in una piastra di coltura tissutale da 10 cm con 10 ml di terreno (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) contenente il 10% di siero fetale di vitello (FCS)).
- Celle di passaggio Phoenix (giorno -3)
- Rimuovere il terreno e lavare con 5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
- Aggiungere 3 mL di tripsina allo 0,25% e incubare a 37 °C in atmosfera di CO2 al 10% per 3 minuti.
- Raccogliere le cellule, quindi pellettare mediante centrifugazione per 3 minuti a 200 x g. Ri-piastrare le celle con 10 mL di terreno fresco e incubare a 37 °C.
- Irradiazione di cellule Phoenix (Giorno -1 pomeriggio)
- Per ridurre al minimo l'ulteriore divisione cellulare, raccogliere le cellule Phoenix come descritto al punto 2.2, risospendere in 5 mL di terreno e irradiare le cellule con raggi gamma su ghiaccio (1000 rad).
NOTA: Prestare attenzione ai lavori con radiazioni per evitare l'esposizione del personale.
- Centrifugare le cellule irradiate, risospenderle in terreno fresco, piastrarle a 2 x 106 cellule (in 10 mL di terreno)/piastra/CAR, e incubare.
- Trasfezione (Giorno 0 - mattina)
- Aspirare il surnatante dalle cellule Phoenix, lavare con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e aggiungere con cautela 7 mL di terreno sierico ridotto (ad es. Opti-MEM) goccia a goccia sulla parete laterale della piastra per evitare di disturbare il monostrato. Trasferire le cellule nell'incubatore.
- Prendi due provette di polipropilene a fondo tondo da 14 ml e aggiungi 1,5 ml di terreno sierico ridotto a ciascuna. In una provetta, aggiungere 40 μl di reagente di trasfezione (vedere la Tabella dei materiali).
- All'altra provetta, aggiungere 15 μg di plasmide Ab-CAR (generato nella fase 1) e 5 μg di plasmide di busta e imballaggio (5 μg di pCL-Eco). Incubare le provette a temperatura ambiente per 5 minuti.
- Aggiungere la miscela di reagenti per trasfezione dal passaggio 2.4.2 alla seconda provetta senza entrare in contatto con i lati della provetta e mescolare pipettando delicatamente la soluzione su e giù per 3 volte. Incubare a temperatura ambiente per almeno 20 minuti.
- Aggiungere 3 mL della miscela goccia a goccia alle cellule Phoenix e metterla in un incubatore per colture tissutali.
- Dopo 4-5 ore aggiungere 1 mL di FCS. Colture di cellule per una notte a 37 °C.
- Variazione media (giorno 1)
- Rimuovere il surnatante contenente i complessi di reagenti plasmidi/trasfezione e smaltirli in conformità con le procedure istituzionali per la manipolazione del materiale infettivo. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura fresco e preriscaldato alle cellule.
- Virus del raccolto per la trasduzione (giorno 2)
- Raccogliere il terreno contenente il virus dalle cellule Phoenix con una siringa sterile, filtrare (0,45 μm) per rimuovere i detriti cellulari residui e raccoglierlo in una nuova provetta.
- Aggiungere il materiale madre di interleuchina-2 umana ricombinante (rhIL-2) a una concentrazione finale di 200 unità internazionali (UI)/mL. Utilizzare immediatamente il virus per la trasduzione (passaggio 5.3). Aggiungere 4 mL di terreno fresco alle cellule Phoenix e metterle nell'incubatore.
- Raccolta ripetuta del virus (giorno 3)
- Ripetere il passaggio 2.6, ma scartare le cellule Phoenix come rifiuti infettivi invece di aggiungere terreno fresco. Questo surnatante viene utilizzato al punto 5.4.
3. Isolamento e attivazione delle cellule T CD8 primarie (dal giorno -1 al giorno 0)
NOTA: In precedenza, raccogliete le cellule T CD8 da topi diabetici non obesi (NOD) femmine a 4-5 settimane, un punto temporale prima dell'inizio dell'infiammazione delle isole. Gestisci tutti i topi seguendo i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC). Le cellule T CD8 sono arricchite dagli splenociti utilizzando un kit di selezione negativa commerciale.
- Piastre di rivestimento con anticorpi CD3/CD28 (giorno -1)
- Aggiungere 1 mL di una miscela di anticorpi CD3 e CD28 anti-topo (entrambi a 1 μg/mL in PBS) a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e incubare a 4 °C per una notte.
- Il giorno successivo, lavare le piastre con 1 mL di PBS sterile 3 volte prima di aggiungere le cellule T CD8 murine (passaggio 4.1).
NOTA: Il numero di pozzetti da rivestire varierà per ogni esperimento, a seconda del numero totale di cellule T CD8 attivate richieste.
- Raccolta di splenociti (Giorno 0)
- Eutanasia di due topi femmina NOD di età compresa tra 4 e 5 settimane utilizzando l'inalazione di CO2 seguita dalla decapitazione. Raccogliere le milze e metterle su un colino cellulare imbevuto di 10 ml di PBS in una capsula per colture cellulari sul ghiaccio.
- In una cappa per coltura cellulare, tagliare ogni milza in 3-5 pezzi, premere i tessuti con uno stantuffo sterile di una siringa da 3 o 5 ml per separare i frammenti di milza e consentire alle cellule di passare attraverso la rete metallica.
- Rimuovere delicatamente i globuli rossi risospendendo gli splenociti in un tampone di lisi dei globuli rossi diluito 1:4 (1 mL di tampone di lisi in 3 mL di PBS per una milza) e incubando per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Quindi, diluire 10 μl della sospensione cellulare con una soluzione di colorante blu di tripano per contare le cellule con un emocitometro e pellettare il resto delle cellule mediante centrifugazione a 350 x g per 7 minuti.
- Arricchimento delle cellule T CD8 (Giorno 0)
- Arricchire le cellule T CD8 mediante selezione negativa utilizzando un kit di isolamento delle cellule T CD8 di topo, seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Per garantire un'elevata purezza, arrotondare sempre il numero di cellule quando si calcola il volume di anticorpi biotinilati da aggiungere (ad esempio, utilizzare il volume di reagenti suggerito per 108 celle per un calcolato 9,1 x 107 cellule).
- Sospendi i pellet cellulari in 400 μl di tampone e 100 μl di cocktail biotina-anticorpi per 1 x 108 cellule, mescola bene e incuba per 5 minuti in frigorifero (4 °C) per consentire il legame degli anticorpi.
- Aggiungere 300 μL di tampone di marcatura e 200 μL di microsfere di anti-biotina per 1 x 108 cellule, mescolare bene e incubare per 10 minuti a 4 °C.
- In attesa della legatura delle microsfere, posizionare la colonna di separazione sul separatore. Lavare la colonna risciacquando con 3 mL di tampone di etichettatura.
- Far passare 1000 μl di miscela microsfera/cella attraverso un filtro cellulare da 40 μm prima di caricarlo sulla colonna di separazione per rimuovere gli aggregati cellulari. Raccogliere il flusso della colonna in una provetta da 15 ml pre-raffreddata.
- Lavare la colonna come indicato dal produttore, raccogliendo tutto l'effluente nello stesso tubo. Determinare il numero di cellule (come al punto 3.2.4) e prelevare mediante centrifugazione a 350 x g per 5 minuti. Lavare le cellule risospendendo in 2 mL di terreno completo di cellule T (RPMI-1640 contenente FCS, 2-mercaptoetanolo, rhIL-2 (200 U/mL), interleuchina-7 di topo (mIL-7, 0,5 ng/mL), ITS, acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) e penicillina-streptomicina) e centrifugando a 350 x g per 5 min.
- Risospendere le cellule in un terreno di cellule T completo preriscaldato (37 °C) a una concentrazione di 0,25-0,5 x 106/mL.
4. Attivazione delle cellule T (Giorno da 0 a 2)
- Aggiungere 2 mL di sospensione cellulare (0,25–0,5 x 106/mL) a ciascun pozzetto rivestito della piastra a 24 pozzetti rivestita con anticorpo CD3/CD28 del passaggio 3.1.2. Utilizzare un movimento vorticoso per erogare le celle in modo uniforme.
NOTA: Aggiungi le celle usando un movimento vorticoso per distribuirle uniformemente e ridurre al minimo gli effetti dei bordi. Se le cellule si raggruppano lungo il bordo dei pozzetti, sia il tasso di trasduzione che la vitalità cellulare diminuiranno.
- Come controllo, piastra lo stesso numero di cellule T CD8 in un singolo pozzetto non rivestito della piastra. Incubare le cellule a 37 °C utilizzando un incubatore gassato al 10% di CO2 per 48 h.
NOTA: Dopo 48 ore, l'attivazione può essere confermata utilizzando un microscopio; le cellule attivate saranno più grandi delle cellule che non hanno incontrato anticorpi anti-CD3/CD28.
5. Trasduzione delle cellule T CD8 attivate (giorni da 1 a 3)
NOTA: Questo protocollo utilizza un metodo di trasduzione di spin. È necessaria una centrifuga con rotore estraibile e adattatori per piastre per colture tissutali in grado di mantenere una temperatura interna di 37 °C. Per garantire la massima efficienza, il giorno della trasduzione preriscaldare la centrifuga a 37 °C prima di raccogliere il virus.
- Preparazione di piastre rivestite di frammenti di fibronectina umana (dal giorno 1 al giorno 2)
- Il giorno 1, aggiungere 0,5 mL di fibronectina (50 μg/mL in PBS) ai pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e incubare per una notte a 4 °C.
NOTA: In genere, sono necessari due pozzetti rivestiti di fibronectina per ogni piastra di cellule Phoenix trasfettate.
- Il giorno 2 rimuovere la soluzione di fibronectina e sostituirla con 1 mL di albumina sierica bovina (BSA) al 2% in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti per "bloccare" i siti di legame non specifici.
- Lavare i pozzetti trattati con 1 mL di PBS sterile. Dopo aver rimosso la soluzione di lavaggio, la piastra è pronta per l'uso; oppure, può essere sigillato e conservato a 4 °C per un massimo di una settimana.
- Raccolta di cellule T CD8 attivate (Giorno 2)
- Raccogliere le cellule T CD8 attivate, contare e calcolare la vitalità cellulare utilizzando il blu di tripano o uno strumento automatizzato adatto.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere a 5 x 106 cellule vitali/mL per la trasduzione. Mantenere una piccola aliquota di cellule in coltura nel terreno completo delle cellule T nell'incubatore di CO2 per fornire un controllo per la successiva selezione cellulare attivata dalla fluorescenza delle cellule trasdotte (fase 6).
NOTA: Dopo l'attivazione per 48 ore, il numero totale di cellule dovrebbe essere aumentato di circa 1,5 volte e avere una vitalità superiore al 95%.
- Trasduzione (Giorno 2)
- Aggiungere 100 μl di sospensione di cellule CD8 attivate per pozzetto (0,5 x 10,6 cellule) alla piastra rivestita di fibronectina. Quindi aggiungere 1,5-2 ml di terreno contenente virus (dal passaggio 2.6) a ciascun pozzetto. Mescolare con un movimento vorticoso per erogare le cellule in modo uniforme (Figura 2).
- Posizionare la piastra in un sacchetto di plastica con chiusura a zip e sigillarla (per fornire un contenimento secondario). Centrifugare a 2000 x g per 90 min a 37 °C.
- Rimuovere la piastra dalla centrifuga. Nella sicurezza biologica, l'armadio rimuove con cura il sacchetto di plastica e si assicura che l'esterno della piastra non sia contaminato da alcun mezzo.
- Quindi trasferire la piastra nell'apposito incubatore a 37 °C di CO2. Dopo 4 ore, rimuovere 1 mL di terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 1 mL di terreno a cellule T completo preriscaldato. Sostituire la piastra nell'incubatore CO2.
NOTA: Trattare tutti i terreni delle cellule trasdotte come rifiuti infettivi.
