1. Microiniezione di embrioni di zebrafish con batteri e cocktail di fagi
NOTA: Per eseguire un'infezione sistemica, l'embrione deve avere una circolazione sanguigna che di solito inizia dopo 26 hpf.
- Dopo 26 hpf, embrioni di decorionato con soluzione di pronasi preparata sciogliendo la polvere di pronasi in terreno E3 ad una concentrazione di 2 mg/mL. Pipettare delicatamente gli embrioni per rompere il corion. Scartare il terreno pronasi/E3 e sciacquare il piatto più volte con E3 fresco per rimuovere tutta la pronasi.
- Anestetizzare gli embrioni di zebrafish in terreno E3 contenente tricaina circa 5 minuti prima delle iniezioni.
- Pipettare gli embrioni anestetizzati nel tracciato preparato al punto 1. Utilizzare una punta di caricamento in gel sottile per allineare gli embrioni in posizione laterale.
- Caricare un ago per microiniezione con circa 5 μL del preparato di P. aeruginosa.
- Inserire l'ago dorsalmente fino al punto iniziale del dotto di Cuvier dove inizia a diffondersi sul sacco vitellino. Iniettare un volume di 1-3 nL e assicurarsi che il volume si espanda direttamente all'interno del condotto ed entri in circolo.
- Circa dopo ogni 50 embrioni iniettati, iniettare una goccia del batterio in una provetta da centrifuga da 1,5 ml con 100 μl di PBS sterile per verificare se il volume di iniezione rimane lo stesso. Piastra l'inoculo su agar LB (vedi Tabella 1) a 37 °C per una notte per valutare l'UFC.
- Trasferire gli embrioni microiniettati in due piastre di Petri pulite con terreno E3 fresco + PTU (Tabella 1) e incubarli a 28 °C.
- In due momenti selezionati: 30 minuti o 3 ore dopo l'iniezione batterica, estrarre dall'incubatrice una delle piastre di Petri con embrioni iniettati in batteri e allinearle nel percorso come descritto in 6.3 per l'iniezione del cocktail di fagi.
- Caricare un ago per microiniezione con circa 5 μL di cocktail di fagi (miscela di quattro fagi che infettano il ceppo PAO1) con una punta di caricamento in gel fine e fissarlo al microiniettore.
- Iniettare il cocktail di fagi nel dotto di Cuvier degli embrioni precedentemente iniettati con batteri.
- Trasferire gli embrioni microiniettati in due piastre di Petri pulite con terreno E3 fresco + PTU e incubarli a 28 °C.
Tabella 1: Preparazione delle soluzioni
| soluzioni | preparazione |
| Soluzione madre per anestesia 25X | 4 mg/mL di Tricaina in H2O distillato. |
| Soluzione di lavoro per anestesia 1X | diluire in H2O distillato la soluzione madre di Tricaina 25X per raggiungere la concentrazione 1X (0,16 mg/mL) di Tricaina di H2O distillato. |
| CsCl d=1.3 | 20,49 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1.4 | 20,28 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1.5 | 34,13 g in 50 mL TN |
| CsCl d=1.6 | 41,2 g in 50 mL di TN |
| Terreno embrionale E3 per embrione di pesce zebra | 1 L 1of E3 (diluire il brodo 50X con H2O distillato) + 200 μl di blu metilico allo 0,05%. Negozio presso RT. |
| Soluzione madre media per embrioni E3 (50X) | 73,0 g di NaCl, 3,15 g di KCl, 9,15 g di CaCl2 e 9,95 g di MgSO4 in 5 L di H2O distillato. Negozio presso RT. |
| LB agar | 10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito, 5 g/L di NaCl, 10 g/L di agar |
| Brodo LB | per 1L: 950 mL di H2O, 10 g di triptone, 10 g di NaCl, 5 g di estratto di lievito |
| PBST | PBS 1X + Tritone X 1% |
| Soluzione fisiologica | 0,9% NaCl |
| Soluzione madre bloccante la pigmentazione 10X | 0,3 mg/mL di fenil tiourea (PTU) in polvere per embrione E3 per embrione di zebrafish |
| Soluzione madre di pronasi 5X | 5 mg/mL di pronasi in polvere in terreno embrionale E3 per embrione di zebrafish |
| Tampone TN | 10 mM Tris HCl pH 8,0, 150 mM NaCl |
