Un'iniezione di plasma ricco di piastrine nel tendine d'Achille sezionato di un ratto

Abstract

Fonte: Greimers, L., et al. Effetti del plasma ricco di piastrine allogenico (PRP) sul processo di guarigione dei tendini d'Achille sezionati dei ratti: una descrizione metodologica. (2018).

Questo video mostra una tecnica per iniettare plasma ricco di piastrine (PRP) nel tendine d'Achille sezionato dei ratti. Un piccolo segmento viene asportato dal tendine d'Achille di un ratto ricevente, il sito viene suturato e il ratto può riprendersi. Contemporaneamente, il sangue intero viene raccolto da un ratto donatore e centrifugato per ottenere PRP, che viene quindi attivato e iniettato nel sito suturato del ratto ricevente per indurre la riparazione del tendine.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione degli animali

1. Utilizzare 132 ratti maschi di Sprague-Dawley di 2 mesi del peso di 320-450 g (120 ratti per la sperimentazione e 12 ratti per il prelievo di sangue, Figura 1). Quindici ratti per ogni gruppo erano sufficienti per una potenza di 0,8 (80% di possibilità di trovare la significatività statistica se esiste l'effetto specificato).
2. Alloggiare tutti i ratti in gabbie classiche in condizioni di isolamento in una struttura convenzionale dotata di una stazione di cambio. Istigare l'allevamento in una rastrelliera IVC (gabbia ventilata individualmente), con l'acquisto specifico di ratti SPF (privi di patogeni specifici).
3. Utilizzare le seguenti condizioni di custodia: intervallo di temperatura da 19-24 °C; umidità relativa: 40-60%; ventilazione: frequenza di rinnovo dell'aria: 10-15 per h; ciclo luce/buio: 12 h-12 h.
4. Sterilizzare tutte le attrezzature di ingabbiamento e utilizzare lettiera irradiata. Implementare sistematicamente l'arricchimento delle gabbie posizionando vassoi di cartone sterili e asciugamani all'interno delle gabbie.
5. Consentire l'accesso alla zona a condizioni limitate: camice da laboratorio nuovo, maschera, guanti, calzature e cuffia per capelli all'ingresso.
6. Effettuare annualmente il monitoraggio della salute delle colonie sugli animali sentinella alloggiati su lettiere sporche, secondo le raccomandazioni Felasa per le strutture convenzionali. Tenere da quattro a cinque animali per gabbia con la dieta irradiata appropriata e fornire acqua acidificata ad libitum. Monitorare quotidianamente.
7. Trasferire i ratti scelti per l'intervento chirurgico in gabbie superiori filtranti nelle sale chirurgiche 2 ore prima dell'intervento.

2. Procedura chirurgica

1. Preparare gli strumenti chirurgici: forbici sottili, una pinza, due pinze emostatiche e un porta aghi. Durante tutte le procedure, indossa guanti, maschera, cappuccio e camice da laboratorio.
2. Dividere casualmente i ratti in due gruppi (PRP e soluzione salina).
3. Togli il topo dalla sua gabbia e pesalo. Usa marchi auricolari numerati per identificare i ratti. Per evitare l'essiccazione degli occhi, posizionare delle gocce d'acqua sulla cornea.
4. Anestetizzare il ratto per via intraperitoneale con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (80 mg/kg di peso corporeo). Mettere gli animali sotto monitoraggio cardio-respiratorio per confermare l'anestesia e controllare i riflessi oculari.
5. Iniettare 50 μL di buprenorfina per via sottocutanea (0,01-0,05 mg/kg ogni 8-12 ore) nella zona del collo come antidolorifico.
6. Radere l'arto posteriore sinistro con un rasoio elettrico, disinfettarlo con 3 sfregamenti alternati di soluzione di iso-betadina/alcol (diluita 1:10) e posizionare il ratto su un tampone caldo (20 °C) al microscopio da dissezione. Posizionare il ratto su decubito laterale con la gamba da operare in posizione superiore. Tenere la zampa con una pinza chirurgica.
7. Usando le forbici, praticare una piccola incisione laterale (20-25 mm) nella pelle che circonda il tendine d'Achille sinistro e sezionare la fascia usando le forbici sottili per esporre il complesso del tendine d'Achille (Figura 2a).
8. Rimuovere il tendine plantare con le forbici (Figura 2b).
9. Tagliare il tendine d'Achille trasversalmente di 5 mm prossimalmente alla sua inserzione calcaneare e rimuovere una porzione lunga 5 mm con le forbici. Non suturare il tendine (Figura 2c, 2d).
10. Sutura la fascia e la pelle con filato riassorbibile, effettuando una sutura overjet (sutura continua). Le suture monofilamento possono anche impedire l'assorbimento dalla pelle nell'incisione chirurgica.
11. Metti il ratto sotto una lampada riscaldante fino al risveglio, e poi rimetti il topo in una gabbia (58 x 38 cm) (Nota bene: non è imposta alcuna immobilizzazione).

3. Preparazione PRP

1. Anestetizzare i ratti donatori con xilazina (10 mg/kg di peso corporeo) e ketamina (80 mg/kg di peso corporeo) mediante iniezione intraperitoneale. L'iniezione di PRP viene eseguita 2 ore dopo l'intervento senza alcuna ri-anestesia.
2. Iniettare 50 μL di buprenorfina per via sottocutanea come antidolorifico.
3. Raccogliere il sangue intero (20 ml per ratto, sanguinamento finale) mediante puntura cardiaca in provette sterili contenenti citrato di sodio tamponato al 3,2% (0,109 M, anticoagulante). Quindi, sopprimere il ratto mediante iniezione intracardiaca.
4. Per ottenere il PRP, centrifugare il sangue per 10 minuti a 150 x g e temperatura ambiente. Questa fase iniziale di centrifugazione a bassa velocità produce due fasi distinte: una fase inferiore costituita da globuli rossi (RBC) che rappresenta circa l'80-90% del volume totale e una fase superiore composta da plasma ricco di piastrine (PRP) (tipicamente il 10-20% del campione di sangue).
5. Raccogliere il PRP (fase superiore) in una provetta di plastica secondaria utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Poiché l'interfaccia tra PRP e globuli rossi è molto allentata, non pipettare troppo vicino all'interfaccia. Se maneggiati correttamente, i globuli rossi contaminanti nel PRP devono essere inferiori a 0,05 x 10³ cellule/μl. Eliminare la fase inferiore rimanente e la provetta primaria per la raccolta del sangue.
6. Determinare il volume di PRP raccolto e misurare la conta piastrinica su un analizzatore ematologico. Questi valori sono necessari per i calcoli per regolare la concentrazione piastrinica nella fase successiva. Un conteggio delle cellule del sangue è utile anche per valutare la potenziale contaminazione con globuli rossi e globuli bianchi. La concentrazione piastrinica nel PRP in questa fase è tipicamente 1 – 1,5 x10⁶/μL.
7. Eseguire una seconda centrifugazione del PRP per 10 minuti a 1.000 x g e temperatura ambiente. Questa fase di centrifugazione ad alta velocità produce un pellet piastrinico sciolto e un surnatante di plasma autologo povero di piastrine (PPP). Utilizzando i valori determinati al punto 3.6, calcolare il volume di surnatante da scartare per concentrare il PRP e raggiungere una concentrazione finale di 2,5 x10⁶/μL.
8. Raccogliere delicatamente il surnatante (PPP) in una provetta di plastica secondaria utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica, lasciando circa due terzi del volume finale calcolato al punto 3.7. Poiché il pellet è sciolto, una quantità significativa di piastrine viene persa quando la PPP viene scartata, riducendo potenzialmente la concentrazione desiderata.
9. Risospendere con cautela il pellet piastrinico con il surnatante rimanente mediante pipettaggio delicato e ripetuto. Misurare la conta piastrinica su questo PRP concentrato. Se necessario, aggiungere il volume appropriato di PPP autologo per raggiungere la concentrazione finale target.
   nota: Utilizzare il PRP entro 3 ore dalla preparazione.
10. Aggiungere 50 μL di CaCl₂ (11 mEq 10 mL) per mL di PRP per attivare le piastrine.
11. Iniettare 50 μl di PRP fresco o soluzione salina con un ago 21G direttamente nel sito operatorio suturato circa 1 ora dopo la preparazione. Durante questo periodo, mantenere il PRP a temperatura ambiente.
12. Monitorare attentamente il recupero funzionale dei ratti durante i giorni successivi all'intervento chirurgico e prima della rimozione del tendine d'Achille.

Risultati

Figura 1: Disegno sperimentale dello studio.

Figura 2: Procedura chirurgica.

(a) Il complesso tendineo dopo la rimozione della fascia circostante.

(b) Rimozione del tendin...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Xilazina (Xyl-M)	Vmd	nessuno	anestetico
Ketamina (Jétamine 1000 CEVA)	CEVA Santé Animale	nessuno	anestetico
Buprenorfina (Vetergésic Multidosis)	ALSTOE	nessuno	antidolorifico
iso-Betadina	MEDA-Pharma	nessuno	Disinfezione
Filato riassorbibile Vicryl 6/0	Johnson & Johnson
Nembutal	CEVA Santé Animale	nessuno	anestetico
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Preserva la struttura del tessuto
Isopropanolo 100%	VWR	2,09,22,364
Etanolo 95%	VWR	2,08,23,362
xilene	VWR	Codice 28973.363
paraffina	VWR	LEIC3950.1006
ematossilina	Millipore	1.15938.0025	colorante
eosina	Millipore	Codice 1.15935.0100	colorante
Eukitt	Sigma-Aldrich	Telefono 3989	Supporto di montaggio
CaCl2