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1. Sintesi di polimero poli(beta amminoesteri) (pBAE) con oligopeptidi finali (OM-pBAE)
- Polimerizzazione di C6-pBAE
- Aggiungere 5-ammino-1-pentanolo (38 mmol; MW = 103,16 Da) 1-esilammina (38 mmol; MW = 101,19 Da) in un pallone di vetro a fondo tondo (100 mL). Quindi, aggiungere 1,4-butandiolo diacrilato (82 mmol; MW = 198,22 Da).
- Preriscaldare il bagno d'olio siliconico a 90 °C, immergere il pallone a fondo tondo nel bagno d'olio e mescolare il composto con l'aiuto di un'ancoretta magnetica per una notte (~18 h). Quindi, prelevare il prodotto dal pallone a fondo tondo e metterlo in freezer a -20 °C.
nota: Il prodotto si presenta sotto forma di polvere appiccicosa e viene estratto dal pallone con l'aiuto di una spatola. È essenziale validare la struttura del polimero ottenuto attraverso 1H-NMR. Gli spettri NMR sono stati registrati in uno strumento a 400 MHz (vedi Tabella dei materiali) utilizzando cloroformio-d e D2O come solventi. Circa 10 mg di ciascun poli(β-amminoestere) sono stati prelevati e disciolti in 1 mL di solvente deuterato.
- Reazione con peptidi per ottenere OM-pBAE
- Aggiungere 25 mL di HCl 0,1 M a peptidi selezionati, ad esempio il peptide Cys-His-His-His con acido trifluoroacetico (TFA, 200 mg), in una provetta da centrifuga da 50 mL precedentemente pesata che può resistere alla liofilizzazione e mescolare manualmente durante la notte per ottenere una soluzione limpida.
- Congelare la soluzione a -80 °C per 1 ora e liofilizzare il peptide cloridrato risultante.
NOTA: Verificare che il peso finale corrisponda al valore teorico.
- Preparare una soluzione di C6-pBAE (0,031 mmol) in dimetilsolfossido. Inoltre, preparare una soluzione del peptide cloridrato (0,078 mmol) in dimetilsolfossido.
- Mescolare le due soluzioni in un tubo con tappo a vite e avvitare il tappo. Agitare la soluzione della miscela a bagnomaria a temperatura controllata di 25 °C per 20 ore con un'ancoretta magnetica.
- Aggiungere la miscela a etere/acetone etilico 7:3 (v/v). Centrifugare la sospensione risultante a 25.000 x g a 4 °C per rimuovere il solvente. Quindi, lavare il solido con etere/acetone etilico 7:3 (v/v) due volte. Quindi, asciugare il prodotto sotto vuoto (<0,2 atm).
- Preparare una soluzione di 100 mg/mL di prodotto in dimetilsolfossido. Il prodotto risultante è chiamato C6-peptide-pBAE. È essenziale validare la struttura del polimero ottenuto attraverso 1H-NMR per confermare la scomparsa dei segnali olefinici associati agli acrilati terminali. Se non utilizzato, il polimero può essere congelato a -20 °C.
2. Formazione di poliplessi
NOTA: Tutte le procedure dovrebbero essere eseguite all'interno di una stanza condizionata per mantenere una temperatura costante.
- Scongelare i polimeri C6-peptide-pBAE e agitare la soluzione.
- Pipettare la miscela di polimero su e giù e preparare una soluzione di 12,5 mM (V1) in acetato di sodio (NaAc). Quindi, agitare il composto e attendere 10 minuti.
- Preparare l'acido ribonucleico messaggero (mRNA) a 0,5 mg/mL e miscelare mediante pipettaggio (V2).
nota: È fondamentale evitare il vortice dell'mRNA.
- Agitare la miscela polimerica alla concentrazione finale per ottenere una soluzione omogenea tra lo stock di polimero in dimetilsolfossido (DMSO) e il tampone acetato.
nota: La concentrazione finale del polimero dipende dal rapporto N/P (gruppi azoto/fosfato) selezionato. Il rapporto N/P dipende da ogni mRNA specifico da utilizzare. Per l'incapsulamento avanzato della proteina fluorescente verde (eGFP), ad esempio, è stato utilizzato un rapporto 25:1, come precedentemente riportato.
- Miscelare la soluzione di materiale genetico e la soluzione di C6-peptidepBAE (25 volte la concentrazione di mRNA) in un rapporto di 1:1 (Vi = V1 + V2).
nota: Il peptide-c6-pBAE viene caricato in una provetta da microcentrifuga in cui l'mRNA viene aggiunto pipettandolo su e giù per la miscelazione. Una volta preparati, il poliplex, l'acido nucleico e le concentrazioni di peptide-pBAE C6 vengono diluite a metà.
- Incubare a 25 °C per 30 minuti in un blocco termico. Precipitare con acqua priva di RNasi 1:2 aggiungendo il campione a una provetta da microcentrifuga precaricata con acqua.
- Includere gli eccipienti. Aggiungere lo stesso volume della miscela di mRNA e pBAE (Vi) in acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) 20 mM e saccarosio al 4% pipettando su e giù. A questo punto, il campione è stato diluito 3 volte.
3. Liofilizzazione dei poliplessi
- Congelare istantaneamente a -80 °C la precedente soluzione polyplex per 1 ora.
- Eseguire l'essiccazione primaria seguendo i passaggi: (1) 1 h a -60 °C e 0,001 hPa; (2) 1 ora a -40 °C e 0,0001 hPa; (3) 4 h a -20 °C e 0,0001 hPa; (4) 12 ore a 5 °C e 0,0001 hPa.
- Conservare immediatamente a -20 °C per evitare la reidratazione fino all'uso.