1. Espressione del nucleo di nanoparticelle proteiche autoassemblanti contenente un fascio a sei eliche (SHB-SAPN) Proteina in E. coli BL21(DE3)
- Miscelare 95 mL del componente A e 5 mL del componente B del terreno in un pallone di vetro sterile da 2 L Erlenmeyer secondo le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere ampicillina a una concentrazione finale di 100 μg/mL.
- Inoculare il terreno con E. coli da una coltura stock di glicerolo precedentemente stabilita. Incubare la coltura a 30 °C con agitazione a 200 rotazioni al minuto (rpm) per 48 h.
NOTA: Lo stock di E. coli BL21 (DE3) utilizzato conteneva il vettore di espressione resistente all'ampicillina con il gene SHB-SAPN. Sebbene il protocollo generale del terreno raccomandi 24 ore di incubazione a 37 °C, 48 ore di incubazione a 30 °C danno una resa più elevata per SHB-SAPN.
- Trasferire la coltura in due provette coniche da 50 mL. Centrifugare le provette a 4.000 x g per 10 minuti con un rotore ad angolo fisso a 4 °C. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet per raccogliere le cellule.
NOTA: Il pellet di cella può essere lavorato immediatamente o congelato a -80 °C fino all'uso.
2. Lisi di E. coli BL21(DE3) mediante sonicazione
NOTA: Utilizzare plastica apirogena e vetreria cotta a 250 °C per almeno 30 minuti. La tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP), come agente riducente, rompe i legami disolfuro all'interno e tra le proteine. Il TCEP è necessario per i tamponi durante questo protocollo se l'antigene visualizzato contiene legami S-S. Solo per il core SHB-SAPN, la presenza di TCEP nei buffer non è essenziale.
- Preparare un tampone privo di imidazolo (8 M di urea, 50 mM di fosfato di sodio monobasico, 20 mM di base Tris, 5 mM di TCEP) pH 8,0 (regolato con 5 N di idrossido di sodio, NaOH) e filtrarlo utilizzando un'unità di filtrazione per bottiglie sottovuoto da 0,22 μm.
- Risospendere le cellule pellettate (dal passaggio 1.3) con 40 mL di tampone privo di imidazolo in una provetta conica da 50 mL. Sonicare le celle risospese con una sonda su ghiaccio per 5 minuti (4 s di sonicazione, 6 s di riposo) con una potenza di sonicazione di 150 W.
- Centrifugare il lisato cellulare (40 mL) a 29.000 x g a 4 °C per 25 minuti in un rotore ad angolo fisso per generare surnatante chiarificato. Trasferire il surnatante in un pallone sterile da 150 ml ed eliminare il pellet. Diluire il surnatante a 100 ml utilizzando il tampone privo di imidazolo (più avanti nel protocollo denominato "campione").
NOTA: Questa fase di diluizione è necessaria per evitare che la pressione del sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (FPLC) diventi troppo elevata durante il caricamento del lisato sulla colonna.
3. Purificazione delle proteine utilizzando una colonna di His
NOTA: Questo protocollo è stato eseguito utilizzando uno strumento FPLC, ma può essere adattato al flusso di gravità.
- Preparare i seguenti tamponi e filtrarli utilizzando un'unità di filtrazione in bottiglia sottovuoto da 0,22 μm: (i) tampone "Tampone A" privo di imidazolo (8 M Urea, 50 mM di fosfato di sodio monobasico, 20 mM Tris base, 5 mM TCEP) pH 8,0; ii) 500 mM di tampone imidazolico "Tampone B" (8 M di urea, 50 mM di sodio fosfato monobasico, 20 mM di Tris base, 5 mM di TCEP, 500 mM di imidazolo) pH 8,0; e (iii) lavaggio con isopropanolo (20 mM Tris, 60% isopropanolo) pH 8,0.
NOTA: Il pH di ciascun tampone è stato regolato con 5 N NaOH.
- Equilibra la colonna His.
NOTA: Per la produzione su scala di laboratorio, questo protocollo utilizza una colonna di His preimpacchettata da 5 mL, ma è possibile utilizzare qualsiasi colonna di dimensioni maggiori.
- Apri il software FPLC e fai clic sull'opzione Nuovo metodo. Si aprirà immediatamente il menu delle impostazioni del metodo. Nel menu a discesa per la posizione della colonna, scegliere la porta C1 3.
- Nel menu a discesa Mostrato da tecnica scegliere affinità. Nel menu a discesa Tipo di colonna scegliere Altro, Histrap HP, 5 mL. Il volume della colonna e le caselle di pressione verranno impostati automaticamente sui valori appropriati.
- Fare clic sul pulsante Struttura metodo. Trascinare i seguenti pulsanti dal menu a comparsa Libreria fasi: equilibrio, applicazione campione, lavaggio colonna ed eluizione accanto alla freccia nell'ordine esatto. Chiudete il menu Libreria fasi.
- Fare clic sul pulsante di equilibratura. I valori elencati nella tabella devono essere "buffer iniziale B" (4%), "buffer finale B" (4%) e "volume (CV)" 5.
- Fare clic sulla casella Applicazione di esempio. Nella casella di caricamento del campione, fare clic sul pulsante di opzione Inietta campione sulla colonna con la pompa del campione. Assicurarsi che la casella accanto alle impostazioni Usa portata dal metodo sia selezionata nella casella dell'iniezione del campione con la pompa del sistema. Accanto alla casella del volume sul lato destro dello schermo, modificare il valore a 20 ml.
- Fare clic sul pulsante Lavaggio colonna. I valori elencati nella tabella devono essere "buffer iniziale B" (4%), "buffer finale B" (4%) e "volume (CV)" 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, deselezionare la casella Abilita.
- Fare clic sul pulsante di eluizione. I valori elencati nella tabella devono essere "buffer iniziale B" 0%, "buffer finale B" 100% e "volume (CV)" 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sulla casella Abilita. Deseleziona le impostazioni Usa dimensione frazione dal metodo e regola la dimensione della frazione a 4 ml nella casella di riempimento sottostante.
- Fare clic sul pulsante Salva con nome nella parte superiore del software. Assegna al file il nome "equilibrio".
- Collegare una colonna di His preimpacchettata da 5 ml alla porta della colonna corrispondente 3 sull'FPLC. Sia il tubo della pompa A che quello della pompa B, così come il tubo della pompa del campione, devono essere immersi in acqua deionizzata filtrata da 0,22 μm. Eseguire il programma di equilibratura.
- Posizionare sia la pompa A che la pompa B, nonché il tubo della pompa del campione, nel tampone privo di imidazolo (tampone A) ed eseguire nuovamente il protocollo di equilibrio.
- Legare il campione alla colonna e purificare la proteina.
- Apri il software FPLC e fai clic sull'opzione Nuovo metodo. Si aprirà immediatamente il menu delle impostazioni del metodo. Nel menu a discesa per Colonna, posizionare scegliere la porta C1 3. Nel menu a discesa Mostrato da tecnica, scegliere affinità. Nel menu a discesa Tipo di colonna scegliere Altro, Histrap HP, 5 mL. Il volume della colonna e le caselle di pressione verranno automaticamente impostati sui valori appropriati.
- Fare clic sul pulsante Struttura metodo. Trascinare i pulsanti dal menu a comparsa Libreria fasi: equilibrio, applicazione campione, lavaggio colonna (Lavaggio 1), lavaggio colonna (Lavaggio 2), lavaggio colonna (Lavaggio 3) ed Eluizione accanto alla freccia in questo ordine esatto. Chiudete il menu Libreria fasi.
- Fare clic sul pulsante Equilibrio. I valori elencati nella tabella devono essere "buffer iniziale B" 4%, "buffer finale B" 4% e "volume (CV)" 5.
- Fare clic sulla casella Applicazione di esempio. Nella casella di caricamento del campione, fare clic sul pulsante di opzione per ilcampione di iniezione sulla colonna con la pompa del campione. Assicurarsi che la casella accanto alle impostazioni Usa portata dal metodo sia selezionata nella casella dell'iniezione del campione con la pompa del sistema.
- Accanto alla casella del volume sul lato destro dello schermo, modificare il valore in 100 ml. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sul pulsante Abilita. Deselezionare la casella Usa dimensione frazione dalle impostazioni del metodo, quindi modificare la dimensione della frazione in 4 ml.
- Fare clic sul pulsante di lavaggio della prima colonna (Lavaggio 1). I valori elencati nella tabella devono essere "buffer iniziale B" 4%, "buffer finale B" 4% e "volume (CV)" 10. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sulla casella Abilita. Deselezionare le impostazioni Usa dimensione frazione dal metodo, quindi modificare la dimensione della frazione in 4 ml.
- Fare clic sul pulsante di lavaggio della seconda colonna (Lavaggio 2). I valori elencati nella tabella devono essere "buffer iniziale B" 0%, "buffer finale B" 0% e "volume (CV)" 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sulla casella Abilita. Deselezionare le impostazioni Usa dimensione frazione dal metodo, quindi modificare la dimensione della frazione in 4 ml.
- Fare clic sul pulsante di lavaggio della terza colonna (Lavaggio 3). I valori elencati nella tabella devono essere "buffer iniziale B" 0%, "buffer finale B" 0% e "volume (CV)" 5. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic su Abilita. Deselezionare la casella Usa dimensione frazione dalle impostazioni del metodo, quindi modificare la dimensione della frazione in 4 ml.
- Fare clic sul pulsante Eluizione. Nella tabella a destra, fai clic sulle informazioni elencate e, nel menu che si apre, fai clic sul passaggio Elimina. Trascinare due volte il pulsante della sfumatura isocratica sulla tabella in modo che ci siano due voci.
- Il valore per la prima voce dovrebbe essere "buffer iniziale B" 30%, "buffer finale B" 30% e "Volume (CV)" 10. Il valore per la seconda voce dovrebbe essere "buffer iniziale B" 100%, "buffer finale B" 100% e "volume (CV)" 10. Accanto allo schema di raccolta delle frazioni, fare clic sul pulsante Abilita. Fai clic sulla casella accanto a Usa la dimensione della frazione dalle impostazioni del metodo.
- Fare clic sul pulsante Salva nella parte superiore del software. Assegnare al file il nome "purificazione". Il tubo della pompa A dell'FPLC deve essere inserito nel tampone di lavaggio privo di imidazolo, mentre il tubo della pompa B deve essere inserito nel tampone imidazolo da 500 mM. Il tubo della pompa del campione deve essere inserito nel campione da 100 ml.
- Eseguire il programma "purificazione" e attendere il momento in cui è necessario l'isopropanolo al 60% (Lavaggio 2). Mettere in pausa il programma; spostare il tubo della pompa A dal lavaggio senza imidazolo al lavaggio con isopropanolo al 60%. Riavvia il programma.
- Una volta completata la fase dell'isopropanolo, mettere nuovamente in pausa il programma e tornare a pompare il tubo A nel tampone di lavaggio privo di imidazolo. Riavvia il programma di purificazione (il resto della corsa è automatizzato).
