Costruzione di un modello murino umanizzato con immunità ingegnerizzata contro l'HIV

Abstract

Fonte: Zhen, A., et al. Immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro l'infezione da HIV nel modello murino umanizzato. J. Vis. Exp. (2016).

Il video dimostra una tecnica per generare un modello murino umanizzato con immunità ingegnerizzata basata su cellule staminali contro il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Il tessuto del timo fetale umano e le cellule staminali ematopoietiche (HSC) ingegnerizzate vengono impiantate nella capsula renale di un topo gravemente immunocompromesso. Le HSC, che esprimono i recettori chimerici dell'antigene (CAR) contro l'HIV, sono mescolate in una miscela proteica gelatinosa che ne promuove la co-localizzazione con il tessuto del timo. Dopo la procedura, le HSC si differenziano in varie cellule immunitarie umane, con conseguente sviluppo di un modello murino umanizzato con un sistema immunitario umano funzionale contro l'HIV.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto. Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Costruzione di Topi Umanizzati Ingegnerizzati con il Recettore Chimerico dell'Antigene CD4

1. Elaborazione del timo fetale e isolamento delle HSC CD34+ dal fegato fetale
   1. Lavorazione del timo
      1. Lavare delicatamente il timo in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, in un tubo conico da 15 ml. Ripetere la fase di lavaggio 3 - 4 volte.
      2. Aggiungere 7 ml di terreno del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) + 10% di siero fetale bovino (FBS) + penicillina/streptomicina (Pen/streptococco). Travasare il tutto in una capsula di Petri sterile da 100 mm.
      3. Con l'aiuto dei bisturi tagliate il timo a pezzetti di circa 1 mm². Posizionare ogni singolo pezzo di timo in un singolo pozzetto su una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare una pinza smussata curva quando si trasferiscono i pezzi di timo sulla piastra a 96 pozzetti.
         1. Aggiungere una piccola quantità di terreno (100 - 200 μl) a tutti i pozzetti in modo che il tessuto non si asciughi. Visualizzate al microscopio (i timoli hanno lobi e dovrebbero assomigliare a sacchi di cellule).
            nota: Scarta tutti i pezzi che sembrano discutibili in qualche modo; C'è spesso tessuto connettivo e questo non dovrebbe essere impiantato.
      4. Rimuovere i pezzi di timo confermati e metterli tutti in un pallone per coltura cellulare T25. Aggiungere 7 ml di terreno RPMI integrati con il 10% di FBS e 450 μg/ml di piperacillina/tazobactam e amfotericina B. Agitare delicatamente il pallone per mescolare. Fermentare il pallone per una notte a 37 ºC/5% CO₂,
         nota: Questo passaggio è necessario per prevenire la contaminazione batterica del tessuto.
      5. (Passaggio facoltativo) Congelare il timo per un uso futuro. Equilibrare i pezzi in siero AB umano al 90% con dimetilsolfossido (DMSO) al 10% per 10 minuti. Congelarli a una temperatura compresa tra 1 ºC/min e -50 ºC, quindi raffreddarli rapidamente a -150 ºC. Quando è pronto per lo scongelamento, scongelare rapidamente in un bagno d'acqua a 37 ºC e lavare delicatamente 3 volte in supporti completi RPMI senza DMSO.
   2. Lavorazione del fegato
      1. Lavare delicatamente il fegato in PBS in un tubo conico da 50 ml. Ripetere la fase di lavaggio 3 - 4 volte.
      2. Aggiungere 10 ml di Iscove's Modified Dulbecco's Media (IMDM) al tubo conico da 50 ml. Decantare il tutto in una capsula di Petri sterile da 100 mm.
      3. Omogeneizzare il tessuto epatico utilizzando due bisturi. Tagliate il fegato a pezzetti di circa 3 mm². Taglia e scarta il tessuto connettivo bianco.
      4. Utilizzare una siringa da 10 ml dotata di un ago smussato calibro 16 per raccogliere i pezzi di fegato e il terreno. Quindi, trasferire in un tubo conico da 50 ml.
      5. Risospendere il terreno e la sospensione tissutale ed espellere altre 5-7 volte per omogeneizzare completamente il tessuto.
      6. Preparare 10 ml di terreno IMDM integrati con enzimi: 500 U/ml di collagenasi, 2.400 U/ml di ialuronidasi e 300 U/ml di DNasi, nonché 450 μg/ml di piperacillina/tazobactam e amfotericina B. Filtrare il terreno con un filtro da 0,22 μm, quindi aggiungere il terreno alla sospensione epatica.
      7. Tappare il tubo conico da 50 ml contenente la sospensione epatica e sigillarlo ermeticamente con una pellicola autosigillante come il Parafilm per evitare perdite. Ruotare in un rotatore di provette nell'incubatrice a 37 ºC per 90 min.
      8. Filtrare la sospensione cellulare digerita attraverso un colino cellulare da 100 μm in una provetta fresca da 50 ml.
         nota: Aggiungere PBS alla sospensione per aumentare il volume totale a 50 ml. Dividerlo in due provette da 50 ml, ciascuna contenente 25 ml di sospensione cellulare.
      9. Appoggiare lentamente e delicatamente le cellule in ciascuna provetta con 10 ml di terreno di centrifugazione a densità (ad es. Ficoll). Centrifuga a 1.200 x g per 20 min senza freno. Nota: tutte le centrifugazioni menzionate in questo protocollo vengono eseguite a temperatura ambiente (25 ºC).
      10. Rimuovere con cautela l'interfaccia (cioè il buffy coat) da ciascuna provetta e trasferirla in due provette separate da 50 ml. Portare il volume di ogni provetta di interfaccia fino a 50 ml con PBS. Centrifugare a 300 x g per 7 - 10 min. Aspirare il surnatante con attenzione.
      11. Unire i due pellet. Lavare altre tre volte con 50 ml di PBS contenente il 2% di FBS. Centrifugare a 300 x g per 7 - 10 minuti ciascuno, aspirando con cura il surnatante.
      12. Risospendere il pellet in 50 ml di terreno RPMI + 10% FBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro prima di procedere allo smistamento delle cellule.
      13. Secondo il protocollo del produttore, selezionare immediatamente le cellule CD34+ utilizzando un kit di selezione CD34 (ad esempio, microsfere CD34).
          nota: In alternativa, le cellule possono essere coltivate durante la notte in terreno RPMI + 10% FBS a 1 milione/ml.
      14. Salva sia le frazioni CD34+ che CD34-.
          nota: In questa fase, le cellule CD34+ e CD34- possono essere congelate utilizzando terreni di congelamento Bambanker o altri mezzi di congelamento. Congelare 1 ml di 4 - 6 x 10⁶ cellule CD34+ per provetta e congelare 1 ml di 40 - 60 x 10⁶ cellule CD34- per provetta.
2. Trasduzione di cellule CD34+
   1. Calcolare il numero di pozzetti di trasduzione necessari per una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti. Un pozzetto può essere utilizzato per trasdurre fino a 8 x 10⁶ cellule. Per ogni topo midollo osseo/fegato/timo (BLT), verranno impiantate 0,5 x 10⁶ cellule CD34+ insieme alle cellule CD34- e al timo sotto la capsula renale e 0,5 x 10⁶ cellule CD34+ verranno iniettate per via endovenosa. Il numero di cellule CD34+ da utilizzare è determinato dal numero di topi (1 milione di cellule per topo).
   2. Rivestire il numero necessario di pozzetti per piastre a 6 pozzetti non trattati con coltura tissutale con 1,25 ml di soluzione di fibronectina umana ricombinante (ad es. Retronectina) (20 μg/ml in PBS) in ciascun pozzetto. Coprire la piastra e lasciarla riposare per 2 ore a temperatura ambiente in una cappa di biosicurezza pulita.
   3. Aspirare la soluzione di fibronectina dai pozzetti e aggiungere 1,25 ml di tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) (PBS con il 4% di FBS) a ciascun pozzetto per il blocco. Lasciare riposare la piastra a temperatura ambiente (25 ºC) per 30 minuti.
   4. Aspirare il tampone FACS e lavare i pozzetti una volta con PBS.
   5. Conservare il PBS nei pozzetti rivestiti fino a quando la piastra non è pronta per l'uso. Conservare la piastra a 4 ºC per una notte se non viene utilizzata immediatamente.
   6. Piastra le cellule CD34+ nel terreno di infezione (2% di albumina sierica umana nel terreno di cellule T privo di siero di Yssel) in pozzetti rivestiti di soluzione di fibronectina (~2 x 10⁶ cellule/ml) e incubazione a 37 ºC per 1 ora.
   7. Utilizzare una pipetta per aggiungere vettori lentivirali ai pozzetti con una molteplicità di infezione (MOI) compresa tra 2 e 10. Mescolare delicatamente e incubare per una notte a 37 ºC.
      nota: Il titolo del vettore del lentivirus utilizzato deve essere determinato in anticipo.
   8. Raccogli le cellule il giorno seguente raschiando delicatamente il fondo dei pozzetti con un raschietto per cellule. Raccogliere le cellule e contare con un emocitometro.
   9. Per preparare le cellule per l'impianto, combinare 0,5 x 10⁶ cellule CD34+ trasdotte con 4,5 x 10⁶ cellule CD34- per topo, aliquote in provette sterili da 1,5 ml con tappo a vite. Centrifugare le celle a 300 x g fino al pellet e aspirare il surnatante. Centrifugarli nuovamente a 300 x g, aspirare il surnatante rimanente utilizzando una pipetta P10 e aspirare con molta attenzione. Mantieni i pellet secchi sul ghiaccio durante lo studio. nota: Per garantire che le cellule siano vitali, utilizzare le cellule pellettate ed eseguire l'intervento chirurgico entro 2-3 ore.
   10. Per preparare le cellule per l'iniezione, centrifugare 0,5 x 10⁶ cellule CD34+ trasdotte per topo in pellet e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in supporti RPMI da 100 μl per topo e mantenerle in ghiaccio.
   11. Per verificare l'efficienza di trasduzione, aliquotare ~1 x 10⁵ cellule CD34+ non trasdotte e trasdotte da ciascuna condizione e coltivare in 200 μl di terreno citochinico (terreno RPMI con il 10% di FBS, integrato con 100 ng/ml di IL-3, IL-6, SCF umano) in una piastra a 96 pozzetti per 5 - 7 giorni a 37 ºC.
       nota: Le cellule utilizzate in questa fase non vengono utilizzate per la chirurgia, ma per garantire che la trasduzione abbia successo e che il vettore non sia tossico per la sopravvivenza e il rinnovamento delle cellule staminali. L'efficienza di trasduzione può essere verificata cercando l'espressione genica del vettore (ad esempio, GFP&CD4) e analizzata mediante citometria a flusso.
3. Trapianti di tessuti per costruire topi geneticamente modificati
   1. Lo stesso giorno prima dell'intervento chirurgico, viene eseguita l'irradiazione total body del NOD. Topi immunocompromessi Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) con un irradiatore di cesio-137 e un dosaggio di 2,7 Gy (270Rad).
      nota: I topi NSG sono gravemente immunocompromessi. Pertanto, la loro sistemazione e manutenzione devono essere conformi ai più elevati standard sanitari ed essere gestite da personale altamente qualificato.
   2. Versare i pezzi di timo e il terreno dal pallone in un piatto da 60 mm. Versare il PBS in un'altra pirofila da 60 mm, che servirà per pulire il trochar e mantenere umido il rene.
   3. Raffreddare i puntali delle pipette a spostamento positivo inserendoli in provette sterili aperte da 1,5 ml con tappo a vite su ghiaccio. Conservare in ghiaccio con i pellet cellulari essiccati e la miscela di proteine gelatinose come Matrigel.
      nota: È importante mantenere fredda la miscela proteica gelatinosa e tutti i tubi o le punte che la toccheranno fino a quando l'ago dell'impianto non viene caricato.
   4. Anestetizzare i topi: pesare i topi individualmente e registrare i pesi; dare un pugno all'orecchio ai topi per numerarli. Iniettarli per via intraperitoneale con 15 μl di ketamina (2,6 mg/ml in soluzione fisiologica)/xilazina (100 mg/ml in soluzione fisiologica) per grammo di peso corporeo). Rimetti i topi nella gabbia e attendi che siano completamente anestetizzati.
      nota: Controlla il livello di anestesia del topo stringendo una zampa. Se il topo sussulta di riflesso, somministrare il 25-50% della quantità originale di ketamina/xilazina per anestetizzare ulteriormente il topo. Aspetta che non sussulti di riflesso per eseguire l'intervento chirurgico.
   5. Usando il rasoio Oster, radere il lato sinistro di ciascun mouse dall'anca alla spalla tra il centro della schiena e lo stomaco. Iniettare per via sottocutanea 0,3 ml di Carprofene diluito (6 mg/kg) nella spalla o nel triangolo inguinale dell'animale (fossa delle gambe). Usando un batuffolo di cotone, metti una piccola goccia di lacrime artificiali su ciascun occhio e appoggia il topo su un lato nella gabbia.
      nota: Limitare la preparazione all'intervento chirurgico a una gabbia (circa 4-5 topi) alla volta.
   6. Lavare la cannula dell'ago per impianti tumorali calibro 16 (trocar) con PBS. Utilizzando un paio di pinze curve smussate, posizionare un pezzo di timo dal piatto da 60 mm nell'apertura della cannula con il trocar appena all'interno dell'apertura, quindi tirare indietro il trocar per aspirare il tessuto nella cannula.
   7. Utilizzare una pipetta a spostamento positivo e un puntale freddo per inserire 5 μl di miscela proteica gelatinosa fredda nella provetta con un pellet di cellule essiccate (miscela CD34+ e CD34- per cellule impiantate) e mescolare delicatamente per generare una sospensione cellulare. Non pipettare su e giù. Pipettare la miscela proteica gelatinosa/la sospensione cellulare nell'apertura della cannula e tirare lentamente indietro il trocar per caricare l'ago.
      nota: Si consiglia di avere un aiutante per caricare la pipetta mentre si manipola l'ago dell'impianto.
   8. Tamponare l'area rasata del topo con iodio povidone e successivamente pulire l'area con una salvietta imbevuta di alcol tre volte. Determina la macchia più scura sotto la pelle. Questo indica la posizione della milza. Il rene è di circa 5 mm dorsale alla milza. Sollevare la pelle con una pinza curva e praticare un'incisione lunga 15 mm con le forbici chirurgiche nella pelle parallela alla milza. Quindi, fai un taglio simile nello strato del peritoneo sottostante. Nei maschi, il rene dovrebbe essere facilmente visibile e può essere estruso semplicemente premendo sull'addome. Puoi sostenere il rene con un emostatico o una pinza smussata curva. Nelle femmine, le ovaie tendono a bloccare il rene da una facile estrazione. Usando un emostato, prelevare l'ovaio ed esporre con cura il rene.
   9. Usa la pinza con punta ad ago per praticare un piccolo foro all'estremità posteriore della capsula renale.
      nota: Non utilizzare queste pinze con punta ad ago per maneggiare materiali a rischio biologico.
   10. Far scorrere l'ago dell'impianto in questo foro e lungo il rene fino a quando l'apertura della cannula non è completamente coperta dalla capsula renale.
   11. Estrudere delicatamente il tessuto sotto la capsula renale ed estrarre nuovamente l'ago. I pezzi di timo possono essere appiccicosi, quindi usa una pinza curva per assicurarti che il pezzo di timo non fuoriesca con l'ago.
   12. Sollevare il peritoneo con la pinza e utilizzare delicatamente l'emostatico per spingere il rene di nuovo in posizione. Legare un punto a doppio nodo nel peritoneo utilizzando suture assorbibili in vicryl 4-0. Utilizzare due clip avvolte Autoclips per chiudere la pelle.
   13. Mescolare le cellule CD34+ trasdotte e preparate per l'iniezione e assorbire 100 μl (0,5x10⁶ cellule) in una siringa da insulina. Iniettare queste cellule nel topo attraverso l'iniezione di vena retroorbitale o altre vie di iniezione endovenosa. Usando un batuffolo di cotone, metti una piccola goccia di lacrime artificiali su ciascun occhio e adagia il topo su un lato in una gabbia.
   14. Una volta che tutti i topi sono stati impiantati, conferma che gli animali stiano riprendendo conoscenza e deambulino normalmente prima di lasciarli.
   15. Cure post-operatorie: iniettare per via sottocutanea 0,3 ml di carprofene diluito (6 mg/kg) e 1,2 ml di soluzione fisiologica sterile in ciascun topo il giorno dopo l'intervento. 2 e 3 giorni dopo l'intervento, iniettare per via sottocutanea 1,5 ml di soluzione fisiologica sterile in ciascun topo. Monitorare i topi e le incisioni per 10-14 giorni dopo l'intervento chirurgico. Rimuovi gli Autoclip e pesa i mouse dopo 10-14 giorni. nota: I topi sono pigri dopo le radiazioni e l'iniezione di soluzione salina impedisce agli animali di disidratarsi.
   16. Dopo 8-10 settimane, controllare l'attecchimento dissanguando i topi ed eseguendo l'analisi FACS sul sangue periferico, colorando per marcatori come CD45, CD3, CD4, CD8 e qualsiasi gene che il vettore dovrebbe esprimere.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit di microsfere CD34	Miltenyi	Codice 130-046-702	Per la selezione di cellule progenitrici CD34+ umane
Bambanker	Wako	Codice 302-14681	per cella di congelamento
Kit di RNA virale QIAamp	Qiagen	Codice: 52904	Per misurare la carica virale nel siero
Citometro a flusso MACSQuant	Miltenyi		Per l'analisi del flusso
BD LSRFortessa™	BD bioscienze		Per l'analisi del flusso
ialuronidasi	sigma	H6254-500MG	Per la digestione dei tessuti
Desossiribonucleasi I	Worthington	LS002006	per digestione dei tessuti
Collagenasi	Tecnologia di vita	Codice 17104-019	per digestione dei tessuti
Sistema di rilevamento PCR in tempo reale CFX	Biorad		Per misurare la carica virale e l'espressione genica
Topi, ceppo NOD. Cg-Prkdcscid Il2RGTM1Wjl/SzJ	Il laboratorio Jackson	Codice: 5557	Per la costruzione dei topi umanizzati
Penicillina Streptomicina (Pen Streptomic)	Thermo Fisher Scientifico	10378016	Per la coltura di cellule
piperacillina/tazobactam	Pfizer	Zosyn	Antimicotico
Amfotericina B (antimicotico Fungizone)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 15290-018	Antimicotico
Clip avvolte AUTOCLIP, 9 mm - 1000 unità	Becton Dickinson	427631	Per chirurgia
Camici chirurgici Aurora sterili poli-rinforzati, 30 per confezione	Medline	DYNJP2707	Per chirurgia
Suture, 4-0, vicryl	Owens e Minor	23000J304H	Per chirurgia
Tamponi per la preparazione dell'alcol	Owens e Minor	3583006818	Per chirurgia
Guanti chirurgici 6 1/2	Owens e Minor	4075711102	Per chirurgia
Terreno a cellule T privo di siero di Yssel	Bioprodotti Gemini	400-102	Per la trasduzione cellulare CD34+
Albumina sierica umana	Sigma-Aldrich	Codice: A9511	Per la trasduzione cellulare CD34+