Generazione di vescicole della membrana plasmatica da cellule staminali del midollo osseo

Abstract

Fonte: Xu, L. et al., Preparazione di vescicole della membrana plasmatica da cellule staminali mesenchimali del midollo osseo per una potenziale terapia di sostituzione del citoplasma.J. Vis. Exp. (2017)

Questo video mostra un metodo per generare vescicole di membrana plasmatica da cellule staminali del midollo osseo facendole passare rapidamente attraverso un filtro a membrana. Questi PMV mostrano un potenziale per la terapia sostitutiva del citoplasma.

Protocol

1. Assemblaggio dell'apparato

1. Per garantire la sterilità, accendere la luce ultravioletta (UV) di una cappa per coltura tissutale per 30 minuti prima dell'uso.
2. Svitare un'unità filtro usa e getta da 25 mm e immergere il tappo e il fondo dell'unità in una tazza di vetro da 200 ml riempita con etanolo al 75% per 30 minuti. L'unità è realizzata in polipropilene per uso medico.
3. Raccogliere il tappo e il fondo dell'unità usando una pinza, scrollarsi di dosso l'etanolo rimanente a mano e lasciare asciugare le parti all'aria per 10 minuti nella cappa.
4. Bagnare una membrana in policarbonato da 19 mm in soluzione salina tamponata con fosfati (PBS) e posizionarla con cura sopra la matrice di supporto del fondo dell'unità. Il film polimerico ha una superficie liscia e piana e pori da 3 μm incisi su traccia.
5. Rimontare l'unità avvitando saldamente il tappo contro il fondo. Assicurarsi che la membrana non sia staccata dal centro.
6. Rimuovere l'ago di una siringa da insulina da 1 ml e aspirare 1 ml di PBS. Collegare la siringa all'unità filtrante, quindi spingere il PBS attraverso l'unità per bagnare il gruppo e verificare se ci sono perdite.

2. Generazione di vescicole di membrana plasmatica (PMV)

1. Stabilire una coltura di cellule staminali mesenchimali del midollo osseo (BMSC), come riportato da Nemeth et al., nel terreno di coltura Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente il 15% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina. Coltivare le cellule in una piastra a 6 pozzetti in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO₂ a 37 °C.
2. Per propagare le cellule, rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il pozzetto con 0,5 ml di PBS senza calcio.
3. Aggiungere 0,5 mL di acido tripsina-etilendiammina tetraacetico allo 0,25% (tripsina-EDTA) e incubare le cellule a 37 °C per 3 minuti. Picchiettare la piastra contro il palmo della mano un paio di volte per facilitare il distacco delle cellule. Arrestare la digestione aggiungendo 1 ml di terreno di coltura.
4. Raccogliere le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 200 x g per 2 minuti in una centrifuga da banco. Risospendere le cellule in 4 mL di terreno di coltura e aliquotare le cellule in due pozzetti di una piastra a 6 pozzetti.
   nota: Le celle di solito raggiungono la confluenza intorno alle 24 ore.
5. Per generare PMV, raccogliere le cellule da un pozzetto (circa 5 x 10⁵ cellule) di una piastra a 6 pozzetti mediante digestione della tripsina e disperdere le cellule in 0,5 mL di terreno di coltura.
6. Caricare le cellule nella siringa da insulina, collegarla all'unità filtro e spingere rapidamente lo stantuffo per spremere le cellule attraverso il filtro. Scartare il mezzo estruso perché dovrebbero esserci solo pochi PMV al suo interno.
7. Caricare altri 0,5 mL di terreno nella siringa e spingerlo rapidamente attraverso il filtro. Raccolto il mezzo della seconda estrusione, che contiene PMV di varie dimensioni.
8. Caricare 150 μl del terreno raccolto in un piatto con fondo di vetro da 35 mm e lasciare che i PMV si depositino sul fondo per circa 10 minuti. Esaminare i PMV con un microscopio a contrasto di fase invertito dotato di una telecamera CCD utilizzando l'obiettivo 20X.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Membrane IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	Poro di 3 mm
Unità filtrante monouso	Xinya, Shanghai, Cina	25 millimetri	Polipropilene di grado medico
Siringa da insulina	Bd	328446	1 ml