Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Mutagenesi UV per Generare Ceppi di Lievito Auxotrofici
- Generare curve di sopravvivenza per determinare le dosi necessarie di irradiazione ultravioletta (UV)
- Preparare i terreni YPD (estratto di lievito, peptone, destrosio) e gli altri reagenti elencati nella Tabella 1 secondo le procedure standard e inoculare singole colonie in 5-10 ml di terreni YPD. Incubare le colture su un tamburo a rulli a 30 °C O/N fino alla saturazione per almeno 8 ore.
- Determinare la concentrazione cellulare delle colture notturne (O/N) utilizzando uno spettrofotometro diluendo le cellule 1:10 in acqua in una cuvetta di plastica. Diluire le cellule a una concentrazione di10-7 cellule/ml in 20 ml di acqua distillata sterile.
- Versare le cellule diluite in una capsula di Petri di plastica sterile e, con il coperchio rimosso, posizionare la piastra 14 cm sotto una lampadina UV.
- Esporre le cellule a dosi seriali di 5.000 μJ e 10.000 μJ di irradiazione UV, estraendo 500 μl di cellule dopo ogni incremento in modo tale che le cellule siano campionate dopo l'esposizione a 0 μJ, 5.000 μJ, 10.000 μJ, 15.000 μJ, 20.000 μJ, 25.000 μJ, 30.000 μJ, 40.000 μJ, e 50.000 μJ di irradiazione UV. Trasferire i campioni di cellule estratte in provette sterili da 1,5 ml e diluirli in serie con incrementi di 1:10 in acqua sterile.
- Pellettare le cellule in ogni diluizione mediante centrifugazione in una microcentrifuga a 16.000 x g per 1 minuto. Aspirare il surnatante e risospendere in un volume di 100 μl di acqua sterile appropriata per la placcatura di cellule di lievito. Pipettare l'intero volume delle cellule risospese su piastre contenenti terreni solidi YPD e utilizzare uno spandiconcime sterile per distribuire uniformemente le cellule su ciascuna piastra.
- Avvolgere i bordi delle piastre in Parafilm per evitare l'essiccazione dei terreni e le piastre di copertura in fogli di alluminio per prevenire la foto-riattivazione e la riparazione delle mutazioni indotte dai raggi UV. Incubare le piastre capovolte a 30 °C per 2-4 giorni per consentire la crescita di colonie di lievito vitali (Figura 1).
- Conta il numero di colonie, facoltativamente con l'aiuto di una penna per contrassegnare le colonie contate, di una penna da banco elettronica portatile o di un supporto da banco con ingrandimento. Tracciare come percentuale del totale delle cellule piastrate a ciascuna dose μJ di irradiazione UV per generare una curva di sopravvivenza per il lievito irradiato (Figura 2).
NOTA: Ci si può aspettare che i ceppi di lievito aploidi richiedano dosi più basse di irradiazione UV rispetto ai ceppi diploidi per raggiungere la stessa percentuale di sopravvivenza. Un ceppo di lievito privo di enzimi funzionali di riparazione del DNA, come il mutante rad1 S. cerevisiae, può essere utilizzato come controllo positivo per indicare la presenza di irradiazione UV a dosi molto basse.
- Determinare la dose di mutagenesi UV da utilizzare per lo screening facendo riferimento alla curva di sopravvivenza stabilita al punto 1.1.7. Il valore x del punto lungo la curva di sopravvivenza in cui y è uguale a 50 è la dose di irradiazione UV alla quale sopravvive il 50% del lievito. Lo screening dei mutanti a questa bassa percentuale di sopravvivenza può portare a una maggiore resa di ceppi mutati con successo, in particolare per il lievito diploide. La dose di sopravvivenza del 50% per WT S. boulardii, come mostrato nella Figura 2, è di circa 18.000 μJ.
NOTA: Sebbene dosi UV così elevate aumentino il rischio di mutazioni nei geni per vie cellulari diverse dal gene marcatore auxotrofico di interesse, questo inconveniente deve essere bilanciato con la necessità di indurre mutazioni in entrambe le copie del gene marcatore auxotrofico. Per i ceppi aploidi in cui solo una copia del gene deve essere mutata, lo screening con una percentuale di sopravvivenza più elevata, ad esempio al 90%, riduce il rischio di ulteriori mutazioni e consente comunque una generazione sufficiente di mutanti auxotrofici.
- Mutagenesi UV e screening per ceppi di lievito auxotrofici
- Preparare il lievito come descritto nei passaggi 1.1.1-1.1.3.
- Esporre il lievito alla dose di irradiazione UV corrispondente al 50% di sopravvivenza, come determinato al punto 1.1.8. Per WT S. boulardii, questa dose è stata determinata in circa 18.000 μJ (Figura 2).
- Raccogliere 1 ml di volumi di lievito e pellet irradiati con raggi UV mediante centrifugazione in una microcentrifuga a 16.000 x g per 1 minuto. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di acqua sterile.
- Selezione di mutanti
- Se si utilizza la selezione, ad esempio con mutanti auxotrofici ura3-, il lievito irradiato su terreni contenenti acido 5-fluoroorotico (5-FOA) per selezionare le cellule prive di un enzima Ura3 funzionale><.
NOTA: Qualsiasi lievito contenente copie funzionali di Ura3 convertirà il 5-FOA nella tossina 5-fluorouracile, portando alla morte cellulare e consentendo una facile selezione delle colonie di ura3 prive di un Ura3 funzionale. Approcci di selezione analoghi sono possibili per LYS2 e LYS5; TRP1;e marcatori MET2 e MET15 utilizzando terreni contenenti acido α-amminoadipico; acido 5-fluoroantranilico; e metilmercurio, rispettivamente.
- Pipettare i 100 μl di cellule risospese su un terreno minimo contenente 5-FOA e utilizzare uno spalmatore sterile per rivestire uniformemente la piastra. Avvolgere le piastre in Parafilm e incubare a testa in giù a 30 °C per 2-4 giorni per consentire la crescita di colonie di lievito vitali.
- Confermare il fenotipo ura3- di qualsiasi colonia che appare sulle piastre 5-FOA riposando su piastre YPD, uracile e 5-FOA (Figura 3). Usa la punta di uno stuzzicadenti sterile per raccogliere parte di una singola colonia e trascina delicatamente le cellule su piastre fresche di YPD, uracile e 5-FOA. Anche in questo caso, incubare le piastre avvolte capovolte a 30 °C per 2-4 giorni.
NOTA: Le colonie vitali appariranno come escrescenze rialzate, approssimativamente circolari, mentre le cellule non vitali appariranno solo come uno striscio opaco senza escrescenze in rilievo (Figura 3).
- Screening dei mutanti
- Se si genera un mutante auxotrofico per il quale non sono disponibili metodi di selezione, preparare diluizioni seriali 1:10 di cellule di lievito irradiate con raggi UV in acqua sterile e pipettare le diluizioni su terreni YPD, utilizzando uno spalmatore sterile per rivestire uniformemente la piastra.
- Avvolgere le piastre in Parafilm e incubare capovolte a 30 °C per 2-4 giorni. Determinare quale diluizione ha permesso la crescita di singole colonie che possono essere facilmente distinte l'una dall'altra, di solito non più di circa 100 colonie per piastra.
- Ripetere la mutagenesi UV dei campioni di lievito come descritto in 1.2.1-1.2.3 e le cellule su piastra a questa diluizione determinata. Pipettare il lievito diluito su terreno YPD, utilizzare uno spalmatore sterile per distribuire le cellule e incubare le piastre avvolte capovolte a 30 °C per 2-4 giorni.
- Screening per auxotrofi mediante placcatura di replica su terreni selettivi privi del metabolita di interesse. Per prima cosa, fissare un tampone di velluto sterile su un supporto per piastre e capovolgere la piastra con colonie irradiate UV sul velluto, segnando l'orientamento della piastra.
- Quindi, capovolgere una piastra nuova priva del metabolita di interesse sul velluto e premere leggermente verso il basso per trasferire le cellule dal velluto alla piastra. Conservare la piastra originale a 4 °C. Avvolgere e incubare la nuova piastra capovolta a 30 °C per 2-4 giorni.
- In alternativa alla placcatura replica, lo screening dei mutanti esegue la ri-striatura delle colonie da YPD su terreni selettivi. Usa la punta di uno stuzzicadenti sterile per raccogliere parte di una singola colonia e trascina delicatamente le cellule su una piastra YPD fresca e una piastra priva del metabolita di interesse. Incubare nuovamente le piastre avvolte capovolte a 30 °C per 2-4 giorni.
NOTA: È necessario prestare attenzione a selezionare singole colonie e striare le colonie più volte per confermare una popolazione omogenea di vere cellule auxotrofiche.
- Confermare ulteriormente il fenotipo delle cellule irradiate inoculando singole colonie in 5-10 ml sia di YPD che di terreni privi del metabolita appropriato (ad esempio, in terreni uracilici per un mutante ura3). Incubare su un tamburo a rulli a 30 °C O/N per confermare la crescita delle cellule nei terreni YPD, ma non in assenza del metabolita.
NOTA: Sebbene i modelli di crescita su terreni solidi debbano indicare chiaramente lo stato auxotrofico del lievito, è possibile che alcuni lieviti tollerino gli stress e formino piccole colonie a crescita lenta su terreni solidi, ma non tollerino le stesse condizioni in terreni liquidi (osservazioni non pubblicate). L'inoculazione in colture liquide dovrebbe quindi essere eseguita per confermare completamente i modelli di crescita dei mutanti irradiati con raggi UV.
- Per la conservazione a lungo termine di mutanti auxotrofici confermati, preparare le scorte di glicerolo inoculando le cellule in 10 ml di YPD e incubandole su un tamburo a rulli O/N a 30 °C. Pellet di celle mediante centrifugazione per 3 minuti a 2.500 x g e terreni di aspirazione. Risospendere le cellule in glicerolo filtrato sterile al 50%, trasferirle in un crioviale e conservarle a -80 °C.
NOTA: I lieviti mutagenizzati UV contengono potenzialmente mutazioni in più geni diversi dal marcatore auxotrofico di interesse. Prima di continuare con l'uso di mutanti auxotrofici verificati, questi ceppi devono essere ulteriormente analizzati attraverso il sequenziamento genico e la valutazione della resistenza al pH, agli stress degli acidi biliari e ad altre caratteristiche rilevanti per i ceppi probiotici, come descritto altrove2. Inoltre, l'uso dell'omologia pcr o del targeting CRISPR/Cas9 per mutare in modo più selettivo i marcatori auxotrofici dovrebbe essere considerato come alternativa alla mutagenesi UV.
2. Trasformazione del lievito
- Trasformazione LiOAc del lievito
- Inoculare singole colonie di lievito in 5-10 ml di terreno YPD e incubare su un tamburo a rulli a 30°C O/N.
- Per indurre la crescita della fase logaritmica e aumentare l'efficienza dell'assorbimento dei plasmidi, determinare la concentrazione cellulare utilizzando uno spettrofotometro per misurare una diluizione 1:10 delle cellule in acqua sterile in una cuvetta di plastica. Diluire le colture O/N a una densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,16-0,2 (circa 2 x 106- 2,5 x 106 cellule/ml) in 50 ml di YPD caldo fresco e incubare le cellule su un agitatore orbitale impostato a 200 giri/min fino a quando la coltura raggiunge circa 1 x 107 cellule/ml, di solito circa 4 ore < >
NOTA: L'efficienza di trasformazione può essere misurata in funzione del numero di unità formanti colonie di lievito (CFU) trasformate con successo per μg di DNA plasmidico. Una maggiore efficienza si traduce in un maggior numero di colonie trasformate per μg di DNA plasmidico. La subcoltura delle cellule di lievito e la raccolta durante la crescita in fase logaritmica è un fattore che aumenta l'efficienza della trasformazione.
- Celle a pellet per centrifugazione a 2.500 x g per 3 min.
- Aspirare il surnatante e trasferire le cellule in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml risospendendo il pellet in 1 ml di acqua sterile.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione a 16.000 x g per 1 minuto in microcentrifuga, aspirare il surnatante e lavare le celle mediante risospensione in 1 ml di tampone TE/LiOAc (Tris EDTA/acetato di litio).
- Ripetere la centrifugazione e risospendere le cellule in tampone TE/LiOAc a una concentrazione di 2 x 109 cellule/ml.
- Preparare miscele di trasformazione con ciascuno dei seguenti elementi: 50 μl di lievito preparato in tampone TE/LiOAc, 5 μl di DNA trasportatore (10 μg/μl) e 1 μl di DNA plasmidico (1 μg). I microgrammi di DNA plasmidico possono essere titolati in quanto l'aumento delle quantità di DNA può o meno portare a un aumento dell'efficienza di trasformazione.
NOTA: Per un ceppo di lievito mutante privo di un marcatore auxotrofico, è possibile trasformare un solo plasmide codificante il marcatore per campione. Inoltre, l'uso di un plasmide codificante una proteina facilmente rilevabile, come la proteina fluorescente verde (GFP), consentirà di determinare in modo efficiente il corretto ripiegamento e l'espressione di proteine eterologhe da parte del ceppo di lievito dopo la trasformazione.
- Ad ogni preparazione, aggiungere 300 μl di PEG/LiOAc/TE e agitare accuratamente. L'incubazione di cellule intatte con polietilenglicole (PEG) è essenziale per una trasformazione efficiente.
- Incubare le preparazioni a 30 °C per 30 minuti con agitazione posizionando le provette per microcentrifuga in un becher posto su un agitatore a piattaforma orbitale a 200 giri/min.
- Aggiungere 35 μl di dimetilsolfossido (DMSO) a ciascuna reazione e celle di shock termico per 15 minuti a bagnomaria a 42 °C. Sebbene ci siano rapporti contrastanti sul vantaggio aggiunto del DMSO, è stato dimostrato che lo shock termico delle cellule di lievito intatte aumenta notevolmente l'efficienza della trasformazione.
- Lavare le celle mediante pellettatura mediante centrifugazione come al punto 2.1.5, aspirando o pipettando il surnatante e risospendendo in 1 ml di acqua sterile. Pipettare delicatamente su e giù per rompere il pellet cellulare.
NOTA: È fondamentale rimuovere completamente il surnatante perché i mezzi utilizzati nella generazione di cellule competenti possono inibire la crescita del lievito e la formazione di colonie.
- Ripetere la pellettatura delle cellule come al punto 2.1.5, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di acqua sterile. Pipettare l'intero volume su una piastra selettiva e utilizzare uno spalmatore sterile per ricoprire uniformemente la piastra con lievito trasformato.
- Avvolgere i bordi delle piastre rivestite in Parafilm per evitare l'essiccazione dei terreni e incubare a testa in giù a 30 °C per 2 giorni per consentire la crescita delle cellule di lievito trasformate. Il successo ed l'efficienza della trasformazione e della selezione auxotrofica di Saccharomyces cerevisiae producono un numero elevato di colonie per ogni preparazione di trasformazione, sebbene la resa possa essere molto inferiore per altri ceppi (Figura 4).
- Conservare le piastre di lievito per un breve periodo (generalmente 1-3 settimane) capovolte e coperte a 4 °C. Preparare le scorte di lievito trasformato in glicerolo come descritto al punto 1.2.5 per la conservazione a lungo termine.
NOTA: Ulteriori studi per testare le CFU trasformate sono necessari per determinare la stabilità del plasmide e valutare la corretta espressione della proteina eterologa. Descrizioni approfondite della stabilità dei plasmidi, dell'uso dell'immunoblotting per rilevare le proteine denaturate recuperate da campioni cellulari, del saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per rilevare proteine tridimensionali correttamente ripiegate e dell'uso della GFP negli studi sui lieviti sono disponibili altrove. La Figura 5 mostra un'immagine rappresentativa del successo dell'espressione della GFP in S. cerevisiae trasformatorispetto alle cellule non trasformate. L'uso di una tale proteina fluorescente è un mezzo per determinare in modo efficiente la produzione di proteine eterologhe di successo.
- Elettroporazione del lievito
- Inoculare singole colonie di lievito in 5-10 ml di terreno YPD e incubare su un tamburo a rulli a 30 °C O/N.
- Determinare la concentrazione cellulare utilizzando uno spettrofotometro per misurare una diluizione 1:10 delle cellule in acqua sterile. Diluire le colture O/N in 100 ml di terreno YPD fresco e caldo fino a un equivalente OD600 di circa 0,3. Incubare le sottocolture a 30 °C su un agitatore orbitale impostato a 200 giri/min fino a raggiungere un OD600 di circa 1,6, solitamente 4-5 ore. Ogni sottocoltura da 100 ml genererà abbastanza cellule condizionate per due reazioni di trasformazione.
- Pellet le celle per centrifugazione a 2.500 x g per 3 min. Aspirare il surnatante e lavare le celle risospendendole in 50 ml di acqua sterile ghiacciata. Ripetere il lavaggio pellettando le cellule, aspirando il surnatante e ririaccendendo in 50 ml di acqua fresca e sterile ghiacciata.
- Pellettare nuovamente le cellule e risospendere in 50 ml di tampone di elettroporazione ghiacciato (1 M di sorbitolo, 1 mM di cloruro di calcio (CaCl2)).
- Ripetere la centrifuga come in 2.2.3, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di LiOAc 0,1 M/10 mM di ditiotreitolo (DTT). Incubare la sospensione cellulare su un tamburo a rulli a 30 °C per 30 min. La preincubazione delle cellule in LiOAc e DTT aumenta sinergicamente l'efficienza dell'elettroporazione.
- Pellettare le cellule come al punto 2.2.3, rimuovere il surnatante e lavare risolundo in 50 ml di tampone per elettroporazione ghiacciato. Ripetere la centrifugazione e risospendere le cellule in un tampone di elettroporazione ghiacciato fino a un volume finale di 1 ml.
- Preparare su ghiaccio: cellule di lievito condizionate, cuvette sterili per elettroporazione e DNA plasmidico. Immediatamente dopo la risospensione finale delle cellule condizionate in 1 ml di tampone per elettroporazione, combinare 400 μl di cellule di lievito condizionate con circa 1 μg di DNA plasmidico e aggiungere a una cuvetta per elettroporazione ghiacciata da 0,2 μm. L'uso di maggiori quantità di DNA può aumentare leggermente l'efficienza della trasformazione. Incubare la reazione su ghiaccio per 5 minuti, quindi elettroporare con l'elettroporatore impostato a 2,5 kV e 25 μF.
NOTA: Come descritto in 2.1.7, un ceppo di lievito mutante privo di un marcatore auxotrofico può essere trasformato con un solo plasmide che codifica il marcatore mutato per campione. Inoltre, l'utilizzo di un plasmide che codifica per una proteina facilmente rilevabile come la GFP consente di determinare in modo efficiente il corretto ripiegamento e l'espressione di proteine eterologhe dopo la trasformazione.
- Trasferire le cellule elettroporate in 8 ml di una miscela 1:1 di sorbitolo YPD:1 M e lasciarle incubare su un tamburo a rulli a 30 °C per 60 minuti.
- Celle a pellet come in 2.2.3 e risospensione in 100 μl di sorbitolo 1:1 YPD:1 M. Placcare l'intero volume su un terreno selettivo contenente 1 M di sorbitolo, avvolgere i bordi delle piastre in Parafilm e incubare le piastre capovolte a 30 °C per 2-5 giorni per consentire la crescita delle cellule di lievito trasformate.
NOTA: È fondamentale testare il lievito trasformato per valutare la corretta espressione della proteina eterologa, come descritto in 2.1.14 e 2.2.7.
- Sonda orale di topi con lievito trasformato
- Eseguire tutte le procedure di cura e manipolazione degli animali secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
- Preparare colture di lievito O/N inoculando singole colonie di lievito auxotrofico trasformato in 5-10 ml di terreno selettivo. Incubare le colture O/N per almeno 8 ore su un tamburo a rulli a 30 °C fino a saturazione.
NOTA: L'uso di proteine di prova codificanti plasmidiche come la GFP consentirà di facilitare i test di espressione proteica nel lievito gavaged, come descritto in 4.7.
- Per la massima induzione dell'espressione proteica e per indurre la crescita della fase logaritmica, preparare le sottocolture dalle colture O/N diluendo a un equivalente OD600 di circa 0,16-0,2 in 50 ml di terreno appropriato, come descritto al punto 2.1.2.
- Determinare la concentrazione delle cellule in subcoltura come indicato al punto 1.1.2 e regolare a10-9 cellule/ml. Preparare una dose di 100 μl per ciascun topo, con qualche centinaio di μl di volume in più per gruppo, per migliorare l'accuratezza e la facilità di caricamento del campione.
- Pellet di celle mediante centrifugazione a 2.500 x g per 3 minuti o in microcentrifuga a 16.000 x g per 1 minuto. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule aggiungendo un volume uguale di acqua sterile e pipettando delicatamente su e giù.
- Fissare un ago per sonda gastrica di calibro appropriato (22 G per topi da 15-20 g) su una siringa sterile da 1 ml e caricare il campione di lievito, assicurandosi di eliminare eventuali bolle e impostare lo stantuffo con incrementi di 100 μl. Caricare un'altra siringa con acqua sterile per controllare i topi con sonda e verificare la presenza di lieviti contaminanti.
- Sollevare il mouse da sottoporre con la mano non dominante, con l'indice e il pollice che afferrano saldamente la pelle intorno al collo (Figura 5A). Infila la coda sotto il mignolo per evitare il movimento della parte inferiore del corpo. Assicurarsi che l'impugnatura sia sicura e impedisca al mouse di muovere la testa per evitare danni ai tessuti interni durante il gavage.
NOTA: Stimare fino a che punto deve essere inserito l'ago della sonda gastrica tenendo l'ago contro il topo in modo che il bulbo sia all'altezza del processo xifoideo dello sterno. L'inserimento di questa lunghezza dell'ago in genere consente al bulbo dell'ago della sonda gastrica di entrare nello stomaco.
- Usando la mano dominante, inserire delicatamente l'ago della sonda nell'esofago del topo inclinando l'ago lungo il palato e la parte posteriore della gola, mantenendolo leggermente a sinistra del centro. Attendere che il topo ingoi il bulbo dell'ago e lasciare che l'ago scenda leggermente fino al punto stimato in 3.7 (Figura 5B). Se si avverte una resistenza durante l'inserimento dell'ago della sonda gastrica o se il topo in qualsiasi momento inizia ad ansimare, rimuovere delicatamente l'ago e provare nuovamente a trovare l'esofago.
- Dopo che il topo ha ingerito il bulbo dell'ago della navetta, premere delicatamente lo stantuffo della siringa per somministrare 100 μl (10-8 CFU) di lievito direttamente nello stomaco del topo.
NOTA: Sebbene i topi non siano in grado di vomitare la soluzione gastricata dopo la somministrazione, è possibile che si verifichi reflusso durante il gavagage. Il corretto inserimento dell'ago per la sonda gastrica, così come la regolazione del volume e della viscosità della soluzione, possono aiutare a limitare il reflusso e garantire un dosaggio accurato.
- Rimuovere con cautela l'ago della sonda gastrica dallo stomaco e dall'esofago del topo e rimettere il topo nella gabbia. Controllare che il topo respiri e si muova normalmente dopo la sonda gastrica per assicurarsi che l'ago della sonda gastrica sia stato inserito correttamente durante la procedura e che non sia stata aspirata alcuna soluzione.
Tabella 1. Elenco dei reagenti. Vengono descritti i reagenti necessari per la preparazione di ciascuna delle soluzioni, dei terreni e delle piastre di lievito e dei tamponi di trasformazione utilizzati per i protocolli in questo manoscritto.
| soluzioni | Terreni di lievitazione e piastre | Reagenti di trasformazione |
| Polietilenglicole (PEG) 50%: | YPD: | TE/LiOAc: |
| 250 g PEG 3350 | 20 g di peptone | 50 ml 10x TE |
| 500 ml di acqua sterile | 20 g di destrosio | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| Filtro sterilizzato | 10 g di estratto di lievito | 400 ml di acqua sterile |
| 1 L di acqua | Filtro sterilizzato |
| autoclave | |
| TE 10x: | Targhe YPD: | PEG/TE/LiOAc: |
| 100 mM Tris | 20 g di peptone | 400 ml 50% PEG |
| 10 mM EDTA | 20 g di destrosio | 50 ml 10x TE |
| pH a 7,5 e sterilizzazione del filtro | 20 g di agar agar | 50 ml 10x (1M) LiOAc |
| 10 g di estratto di lievito | |
| 1 L di acqua | |
| autoclave | |
| 20% di glucosio: | Mezzi selettivi per l'uracile | DNA PORTATORE (DNA SS): |
| 200 g di destrosio | 2 g di miscela di aminoacidi priva di uracile | Conservare a -20 °C e prima dell'uso scaldare per 1-2 minuti a 100 °C per sciogliere i fili e conservare in ghiaccio |
| 1 L di acqua | 6,7 g lievito base azotata senza aminoacidi | |
| Filtro sterilizzato | 1 L di acqua | |
| Sterilizzare in autoclave o con filtro sterile | |
| Aggiungere il 20% di glucosio 1:10 prima dell'uso | |
| 50% di glicerolo: | Piastre di uracile: | Tampone per elettroporazione: |
| 500 ml di glicerolo | In un matraccio da 250 ml: | 1 M di sorbitolo |
| 500 ml di acqua | 2 g di miscela di aminoacidi priva di uracile | 1 mM di CaCl2 |
| autoclave | 6,7 g lievito base azotata senza aminoacidi | Riempire con acqua distillata |
| 150 ml di acqua | Autoclavare e conservare a 4 °C |
| In un matraccio da 2 L: | |
| 20 g di agar agar | |
| 750 ml di acqua | |
| Collegare in autoclave separatamente i palloni e miscelarli con 100 ml di glucosio al 20% | |
| IMDM completo | Piastre 5-FOA+: | LiOAc/DTT |
| 500 ml di Dulbecco's Media Modificato di Iscove | Autoclave in matraccio da 2 L: | 0,1 M LiOAc |
| 5 ml di penicillina streptomicina glutammina 100x | 20 g di agar agar | 10 mM DTT |
| 500 μl di 2-mercaptoetanolo | 750 ml di acqua | |
| Siero fetale bovino inattivato al calore al 10% | mescolare: | |
| 2,5 ml di piruvato di sodio 100 mM | 6,7 g lievito base azotata senza aminoacidi | |
| 2 g di miscela di aminoacidi senza uracile | |
| 150 ml di acqua tiepida | |
| Quando è freddo, aggiungere: | |
| 0,05 g di uracile in polvere | |
| 1 g di 5-FOA | |
| Agitare e filtrare, sterilizzare | |
| Aggiungi alla soluzione di agar autoclavato | |
| Mescolare con 100 ml di glucosio al 20% | |
