Generazione di neutrofili anti-angiogenici associati al tumore

Abstract

Fonte: Pylaeva, E., et al. Trasferimento di neutrofili manipolati associati al tumore in topi portatori di tumore per studiare il loro potenziale angiogenico in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video dimostra un test per generare neutrofili associati al tumore (TAN) anti-angiogenici. Dopo l'assunzione di un tumore di melanoma murino contenente TAN pro-angiogenici, le singole cellule vengono isolate utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e trattate con un inibitore della nicotinammide fosforibosiltransferasi (NAMPT) per ridurre la capacità di stimolare l'angiogenesi.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

NOTA: Lo schema generale del protocollo è mostrato nella Figura 1.

1. Preparazione della linea cellulare di melanoma B16F10

1. Preparare cellule micoplasma-negative cresciute fino a un monostrato confluente al 90% (circa 10 x 10⁶ cellule/matraccio T75) nel terreno di Dulbecco modificato di Iscove completo (IMDMc: IMDM + 10% siero fetale bovino (FBS) + 1% penicillina-streptomicina).
2. Rimuovere il terreno e sciacquare le celle con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Applicare 6 mL di una soluzione di distacco cellulare contenente enzimi proteolitici e collagenolitici (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 2 minuti.
3. Battere delicatamente il pallone per mobilitare le cellule aderenti rimanenti dal fondo. Raccogliere la sospensione cellulare in provette da 15 mL e centrifugare a 300 x g per 7 min e 20 °C.
4. Rimuovere il surnatante e risospendere bene il pellet in 1 mL di PBS. Aggiungere 14 mL di PBS e centrifugare (300 x g e 20 °C per 7 min).
5. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS.
6. Contare le cellule e risospenderle alla concentrazione di 3 x 10⁶/mL di PBS (per la fase 2) o di 6 x 10⁶/mL di PBS (per la fase 6) per l'iniezione. Mantenere le cellule in ghiaccio per un massimo di 30 minuti.

2. Modello tumorale allogenico nei topi

1. Utilizzare 10 topi femmina Ifnar1-/- di 8-12 settimane che vengono tenuti in condizioni prive di patogeni specifici (SPF).
   nota: I topi femmina sono preferibili in un modello sottocutaneo di crescita tumorale, poiché i maschi sono più aggressivi e quindi inclini a infrazioni del sito tumorale, che influenza la crescita del tumore.
2. Radere la pelle del topo sul fianco con un rasoio elettrico e disinfettare la pelle con un fazzoletto bagnato con etanolo al 70%.
3. Raccogliere le cellule di melanoma B16F10 preparate a una concentrazione di 3 x 10⁶/mL di PBS (vedere il passaggio 1) in una siringa da 1 mL e un ago da 0,4 x 19 mm. Iniettare 100 μl di sospensione per via sottocutanea.
   1. Mescolare bene le cellule prima di ogni iniezione. Utilizzare aghi di diametro non inferiore a 0,4 mm per non disturbare le cellule tumorali.
4. Metti fino a 5 topi in una gabbia e controlla le dimensioni del tumore (lunghezza, larghezza e profondità) con un calibro per 14 giorni.
   nota: Secondo le normative sugli animali, la dimensione del tumore non deve superare i 15 mm di diametro, i topi con tumori più grandi o necrotici/aperti devono essere sacrificati in anticipo.
5. Al giorno 14, sacrifica i topi nella camera di CO₂.
6. Disinfettare la pelle con etanolo al 70% e rimuovere i tumori con forbici e pinze in una capsula di Petri sterile. Conservare i tumori in una provetta da 50 ml in Dulbecco's Modified Eagle Medium completo (DMEMc: DMEM + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina) su ghiaccio.

3. Isolamento TAN

1. Posizionare i tumori in piastre sterili a 6 pozzetti, 5 tumori per pozzetto. Tagliare i tumori in pezzi di 2-3 mm con forbici sterili.
   1. Digerire con 1 mL di soluzione di dispasi/collagenasi D/DNasi I (0,2 mg/0,2 mg/100 mg in 1 mL di DMEMc) per tumore. Incubare a 37 °C, 5% CO₂ in un incubatore umido e mescolare con una siringa da 10 ml senza ago ogni 15 minuti per 3 volte.
2. Per rimuovere le fibre non digerite, incastrare le cellule attraverso filtri da 100 μm in provette da 15 mL (un pozzetto per filtro per provetta). Aggiungere PBS a 15 mL, provette da centrifuga a 460 x g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
3. Lisi eritrociti con un tampone di lisi (NH₄Cl 150 mM, KHCO₃ 10 mM, EDTA 0,1 mM, pH 7,3, 20 °C) aggiungendo 1 mL in ciascuna provetta. Mescolare bene e unire la soluzione di tutte le provette in una. Interrompere la reazione dopo 2 minuti con 11 mL di DMEMc ghiacciato (4 °C).
4. Centrifugare a 460 x g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere il pellet con 15 mL di PBS freddo. Centrifugare a 460 x g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
5. Risospendere il pellet in 1 mL di PBS. Aggiungere 3 μL di anticorpi Fc-block (CD16/CD32, stock 0,5 mg/mL) e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
6. Aggiungere anticorpi: 10 μL di Ly6G-ficoeritrina (Ly6G-PE, stock 0,2 mg/mL) e 10 μL di CD11b-alloficocianina (CD11b-APC, stock 0,2 mg/mL). Aggiungere 20 μl di colorante vitalizzante 6-diammidin-2-fenilindolo (DAPI, stock 5 mg/mL) e incubare su ghiaccio al buio per 30 min.
   nota: È possibile utilizzare un'altra combinazione di coloranti vitali e coniugati fluorescenti di anticorpi.
7. Aggiungere PBS fino a 15 mL, centrifugare a 460 x g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
8. Risospendere il pellet in DMEMc alla concentrazione di circa 10 x 10⁶/mL e tenere in ghiaccio.
9. Selezione dei neutrofili CD11b^{+ Ly6G hi} alive (DAPI-negativi) con un selezionatore cellulare attivato dalla fluorescenza (strategia di gating vedi Figura 2).
   nota: Mantenere la provetta con sospensione cellulare e la provetta con DMEMc per celle selezionate a 4 °C. Utilizzare le seguenti impostazioni di selezione ottimali: un ugello da 70 μm, una velocità di soglia massima di 22.000 eventi/secondo e una portata di 1-3.
10. Controllare la purezza dei neutrofili selezionati utilizzando un citometro per una purezza consigliata del >95%.
11. Centrifugare i neutrofili selezionati a 460 x g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere le cellule selezionate in DMEMc alla concentrazione di 1 x 10⁶/mL.
    nota: Il numero atteso di neutrofili in un tumore B16F10 di 14 giorni (diametro 10 mm) è di circa 3 x 10⁴ cellule.

4. Inibizione del NAMPT nei TAN in vitro

1. Preparare il brodo FK866 (inibitore NAMPT) in dimetilsolfossido (DMSO) a una concentrazione finale di 100 mM.
2. Seminare i neutrofili selezionati (passaggio 3.11) in 2 pozzetti di una piastra con fondo a U a 96 pozzetti (1,5 x 10⁵ neutrofili/pozzetto). Aggiungere FK866 nel pozzetto di intervento (concentrazione finale di 100 nM) e una quantità uguale di DMEMc con DMSO nel pozzetto di controllo. Incubare per 2 ore a 37 °C, 5% CO₂ in un incubatore umido.
3. Centrifugare a 460 x g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere in 200 μL di PBS in ciascun pozzetto. Ripeti 2 volte.
4. Centrifugare a 460 x g, 4 °C per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Risospendere in un terreno di crescita delle cellule endoteliali commerciale (integrato con 4 μL/mL di integratore per la crescita delle cellule endoteliali, 0,1 ng/mL di fattore di crescita epidermico umano ricombinante, 1 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti basici umani ricombinanti, 90 μg/mL di eparina e 1 μg/mL di idrocortisone) a una concentrazione finale di 0,2 x 106 cellule/mL (in 0,75 mL) (per la fase 5) o in PBS alla concentrazione finale di 0,6 x 10⁶ cellule/mL ( in 0,25 mL).

Risultati

Figura 1. Lo schema del protocollo. Passaggio 1. Preparazione di una linea cellulare di melanoma B16F10; 2. Modello tumorale allogenico nei topi; 3. Isolamento dei TAN dai tumori; 4. Inibizione del NAMPT nei TAN in vitro; 5. Stima delle proprietà angiogeniche dei TAN nel saggio dell'anello aortico; 6. Trasferimento adottivo dei neutrofili trattati nel modello tumorale allogenico; 7. Monitoraggio dell...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Tubi da 15 ml	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germania	6,25,54,502
Tubi da 50 ml	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania	227261
Punte sterili da 5 ml / 10 ml / 25 ml per la pipetta automatica	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania	6006180 / 607180 / 760180
Piastre per colture cellulari a fondo piatto a 6 pozzetti	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germania	8.33.920
Piastre per colture cellulari a fondo piatto a 96 pozzetti	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania	Codice 655180
Piastre per colture cellulari con fondo a U a 96 pozzetti	Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germania	Codice 65018
antitopo CD11b	BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti	553312	clone M1/70, coniugato con APC, 0,2 mg/mL
anti-topo Ly6G	BioLegend, California, Stati Uniti	127608	clone 1A8, PE-coniugato, 0,2mg/mL
BD FACS AriaII	BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti		Selezionatore cellulare
calibratore	Vogel Germania, Kevelaer, Germania
Contatore di celle Casy	Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germania
Filtri sterili Cell Trics 50μm / 100 μm	Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germania	04-004-2327 / 04-004-2328
Centrifuga Rotina 420 R	Andreas Hettich, Tuttlingen, Germania	4706
Collagenasi D	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania	11088858001
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dilattato)	BioLegend, California, Stati Uniti	422801	Stock: 5mg/ml
Dispase I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania	D4818-2MG
DMEM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti	Codice 41966-029	DMEM completo: DMEM + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina
DMSO (Dimetilsufossido)	WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germania	WAK-DMSO-10	CryoSure-DMSO
DNasi I	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania	DN25-100MG
DPBS	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti	Codice 14190-094
Terreno di crescita delle cellule endoteliali	PromoCell, Heidelberg, Germania	C-22010
FBS (Siero Fetale Bovino)	Biochrom, Berlino, Germania	S0115
Blocco Fc (Anti-mouse CD16/32)	BD Pharmingen, Becton Dickinson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti	553142	clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL
FK 866 cloridrato	Axon Medchem, Groningen, Paesi Bassi	Assone 1546	Magazzino: 100 mM
IgG H&L anti-coniglio di capra	Abcam, Cambridge, Regno Unito	ab97075	Cy3-coniugato, Stock: 0,5 mg/mL
Incubatore a CO2 Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stati Uniti	51026334
IMDM	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti	Codice 12440-053	IMDM completo: IMDM + 10% FBS + 1% penicillina-streptomicina
Rasoio Isis GT420	B. Braun Asculap, Suhl, Germania	90200714
Membrana basale Matrigel Matrix	Corning Life Sciences, Amsterdam, Paesi Bassi	7205011
Monoclonale anti-actina, α-muscolo liscio	Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germania	F3777	Coniugato FITC, nessuna informazione sulla concentrazione delle scorte
Aghi 0,4 mm x 16 mm	BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti	Codice 302200
Neomount	Merck, Darmstadt, Germania	HX67590916
Siero di capra normale	Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Stati Uniti	005-000-121
Penicillina Streptomicina	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti	Codice: 15140-122
Pipetta automatica Pipetus	Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germania	Codice 9907200
Montante antisbiadimento ProLong Gold con DAPI	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti	P36935
coniglio anti topo Laminin gamma 1 catena	Immundiagnostik, Bensheim, Germania	AP1001.1	Nessuna informazione sulla concentrazione delle scorte
StemPro Accutase	Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, Stati Uniti	Codice A1105-01
Bisturi sterile per lo smaltimento (n. 15)	MedWare, Napoli, Stati Uniti	Codice 120920
Siringhe da 1 ml	BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti	303172
Siringhe da 10 ml	BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, Stati Uniti	Codice 309110
Palloni sterili per colture cellulari T75	Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germania	83,39,11,302