Una tecnica di coniugazione avidina-biotina per la presentazione di antigeni bersaglio su Mycobacterium bovis BCG

Abstract

Fonte: Liao, T. A., et al., Espressione di antigeni esogeni nel vaccino BCG Mycobacterium bovis tramite decorazione superficiale non genetica con il sistema avidina-biotina. J. Vis. Exp. (2018).

Il video mostra una tecnica per caricare antigeni su Mycobacterium bovis BCG per migliorare le sue proprietà immunogeniche. Il metodo utilizza il sistema avidina-biotina per rivestire la superficie batterica con antigeni esogeni.

Protocollo

1. Biotinilazione della superficie cellulare BCG

1. Coltivare BCG in brodo Middlebrook 7H9 con il 10% di OADC (soluzione di acido oleico, albumina e destrosio) e lo 0,05% di Tween 80 a 37 °C su una piattaforma shaker a 50 giri/min fino a OD = 0,5-1,
   NOTA: Il BCG è un agente patogeno di livello 2 di biosicurezza e tutti gli esperimenti relativi al BCG devono essere eseguiti in una cabina di biosicurezza con adeguati dispositivi di protezione individuale.
2. Lavare 10,⁹ BCG 3 volte con 500 μL di PBS ghiacciato privo di endotossine più lo 0,1% di Tween80 (PBST) (pH 8,0). Sospendi il pellet BCG in PBS sterile privo di endotossine.
3. Immediatamente prima dell'uso, preparare 1 mL di 10 mM di biotina Sulfo-NHS SS in acqua filtrata sterile.​
   1. Incubare i batteri con 1 mL di 0,5 mM di biotina Sulfo-NHS SS a temperatura ambiente per 30 minuti.
4. Lavare i batteri marcati 3 volte con 500 μL di PBST freddo ghiacciato per rimuovere il reagente di biotinilazione non reagito.
   1. Risospendere il pellet in 1 mL di PBST.

2. Legame della proteina monomerica di fusione dell'avidina alla superficie biotinilata del BCG

1. Miscelare 5 x 10⁸ BCG biotinilato con la proteina Avi (10 μg/mL finale in PBS-T) per 1 ora a temperatura ambiente sulla piattaforma dell'agitatore.
2. Lavare i batteri 3 volte con 500 μL di PBST freddo ghiacciato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
RPMI 1640 senza endotossine	Tecnologie StemCell	Telefono 36750
Sulfo-NHS SS biotina	Thermo Fisher	Codice 21328
Brodo Middlebrook 7H9	Sistemi diagnostici BD	Codice 271310
OADC	Sistemi diagnostici BD	B11886
Interpolazione 80	Sigma-Aldrich	P1379