Un test per l'analisi del test β-glucano come strategia di immunoterapia contro le cellule tumorali cerebrali

Abstract

Fonte: Folgado-Dorado, C. et al., Isolamento e purificazione del β-glucano fungino come strategia di immunoterapia per il glioblastoma. J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra un test in vitro che utilizza β-glucani per attivare le cellule microgliali per la produzione di radicali superossido, una specie reattiva dell'ossigeno. Nelle cellule tumorali cerebrali, gli ossidanti reattivi generati sopprimono attivamente la proliferazione delle cellule tumorali e inducono la morte cellulare.

Protocollo

Studio in vitro della stimolazione microglia indotta da β-glucano

1. Coltura cellulare di cellule di glioblastoma e microglia di topo in vetrini da camera a 8 pozzetti

NOTA: Questo protocollo è specifico per le linee cellulari GL261 (glioblastoma) e BV2 (microglia). Tuttavia, con lievi modifiche, questi passaggi potrebbero potenzialmente essere utilizzati per studiare altre linee cellulari tumorali e immunitarie.

1. Preparare il terreno completo Eagle's medium (DMEM) di Dulbecco modificato con L-glutammina, 4,5 g/L di D-glucosio e senza piruvato. Aggiungere il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina/streptomicina. Preriscaldare il materiale a bagnomaria a 37 °C per 15 minuti.
2. Scongelare le aliquote congelate di BV2 e GL261 in un bagno d'acqua (37 °C) per 2 minuti e, poco prima che si scongelino completamente, trasportarle in una cappa a flusso laminare e placcare le cellule in due diversi flaconi sterili T25 (uno per ciascuna linea cellulare).
3. Incubare i palloni T25 a 37 °C, 5% CO₂ fino a quando la coltura non è confluente.
   nota: A seconda delle condizioni di congelamento e del tempo di crioconservazione, il tempo fino alla confluenza può variare. Queste linee cellulari di solito richiedono dai 3 ai 5 giorni per raggiungere la confluenza in un pallone T75.
4. Dopo che la coltura cellulare BV2 diventa confluente, trasferirla in vetrini da camera a 8 pozzetti 0,6 x 10⁶ cellule/pozzetto. Conservare i vetrini della camera a 8 pozzetti nell'incubatore per 24 ore.
5. Una volta che le cellule della microglia sono state piastrate nei vetrini della camera a 8 pozzetti, ripetere lo stesso protocollo con le cellule GL261.

2. Attivazione della microglia con β-glucani

1. Rivestire le cellule BV2 con quattro diversi β-glucani (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum e H. erinaceus) a una concentrazione di 0,2 mg/mL per 72 ore. Una condizione sperimentale deve rimanere non trattata (terreno normale), fungendo da gruppo di controllo.
2. Raccogliere il surnatante con una pipetta dopo 72 ore e far passare il volume rimanente attraverso un filtro per siringa da 0,20 μm. Quindi, congelare il surnatante a -80 °C per almeno 24 ore.

3. Trattamento di GL261 con terreno pre-attivato condizionato con microglia

1. Una volta che il GL261 è confluente all'80% all'interno dei vetrini della camera a 8 pozzetti, aggiungere un terreno microgliale trattato con β-glucano a una concentrazione di volume finale del 25% per 72 ore (volume totale: 250 μl/pozzetto).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini per camera a 8 pozzetti	Thermo Fisher, Stati Uniti	Codice 171080
Il medio Eagle's modificato di Dulbecco, Gluta MAXTM	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, Stati Uniti	10564011
Extenda (α- Amilasi/Glucoamilasi)	Novozymes, Danimarca
Siero fetale bovino	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, Stati Uniti	A4736301
Soluzione salina tamponata con fosfati	Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, Stati Uniti	Codice 1010-015
Penicillina/streptomicina	Sigma-Aldrich, St. Louis	P4458
incubatrice	Eppedorf	Galassia 170S