$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento della milza dai topi
- Preparare 1640 RPMI (Roswell Park Memorial Institute): 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES), 1 mM di piruvato di sodio, 50 μM di β-mercaptoetanolo e 1% di penicillina/streptomicina.
- Eutanasia di topi maschi C57bl/6 di 10-12 settimane mediante inalazione di CO2. Spruzzare il petto e i lati del mouse con etanolo al 70%. Sul lato sinistro, aprire con cautela la pelle e la cavità peritoneale per esporre la milza.
- Usando una piccola pinza, sposta con cautela l'intestino e il fegato sul lato sinistro del topo e, usando le forbici sottili, asporta delicatamente la milza><.
nota: Questo passaggio deve essere eseguito con molta attenzione, poiché i danni al tratto gastrointestinale possono indurre contaminazione.
- Porre ciascuna milza asportata in una provetta conica da 15 mL contenente 3 mL di terreno RPMI 1640.
2. Generazione di sospensioni a singola cellula dalla milza
NOTA: La milza può essere dissociata in una sospensione unicellulare combinando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica.
- Preparare la soluzione per la digestione della milza aggiungendo collagenasi D (1 mg/mL; 0,29 U/mg liofilizzato) e DNasi I (0,1 mg/mL) al terreno RPMI 1640 preparato (vedere passaggio 1.1)
- Utilizzare una pinza per trasferire la milza in una provetta C (provetta di dissociazione) contenente 3 ml di soluzione per la digestione della milza.
- Eseguire la dissociazione meccanica utilizzando un omogeneizzatore semiautomatico secondo le istruzioni del produttore.
- Posizionare il tubo C sull'omogeneizzatore semiautomatico, assicurandosi che il tubo C sia posizionato saldamente sul braccio rotante. Una volta posizionato il tubo C, premere il pulsante di avvio sull'omogeneizzatore semiautomatico per eseguire il protocollo Spleen 04.01 per 60 s.
NOTA: La dissociazione meccanica può essere eseguita anche posizionando un filtro da 40 μm sopra una provetta conica da 50 mL e macinando delicatamente la milza attraverso il filtro. Dopo aver macinato la milza, sciacquare il filtro da 40 μm con 10 mL di terreno RPMI.
- Dopo la dissociazione meccanica, staccare la provetta dall'omogeneizzatore ed eseguire la digestione enzimatica. Incubare i campioni per 15 minuti a 37 °C in rotazione continua (20 giri/min).
- Trasferire la soluzione pipettandola in una provetta conica da 50 mL dopo averla filtrata attraverso un colino da 40 μm. Lavare il colino da 40 μm con 10 mL di PBS di Dulbecco (dPBS). Centrifugare le celle a 300 x g per 10 minuti a 4 °C.
- Dopo la centrifugazione, aspirare completamente il surnatante e lavare il pellet risospendendolo in 10 mL di dPBS. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C.
3. Isolamento di DC CD11c+ dalla sospensione splenica a singola cellula
- Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di dPBS e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e l'esclusione del blu di tripano.
- Pellettare le celle mediante centrifugazione a 300 x g, per 10 min a 4 °C.
- Aspirare completamente il surnatante e risospendere il pellet in 400 μL di tampone di smistamento cellulare (MAC) attivato magneticamente.
- Aggiungere 100 μl di microsfere CD11c (vedi Tabella dei materiali) per 1 x 108 cellule.
- Agitare la sospensione cellulare e incubare per 10 minuti in frigorifero a 4 °C.
- Aggiungere 10 mL di tampone MAC alle celle di lavaggio. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C.
- Aspirare completamente il surnatante e risospendere in 500 μL di tampone MAC.
4. Separazione Magnetica dei DC CD11c+
NOTA: La separazione magnetica viene eseguita manualmente con un separatore magnetico (vedi Tabella dei materiali) dotato di colonne LS. La separazione magnetica può essere eseguita automaticamente anche con un separatore magnetico automatizzato. (vedi Tabella dei materiali).
- Posizionare la colonna LS nel campo magnetico del separatore MAC e una provetta conica da 15 mL sotto ciascuna colonna per raccogliere il flusso.
- Sciacquare la colonna LS con 3 mL di tampone.
- Posizionare la sospensione cellulare su ciascuna colonna LS e raccogliere il flusso contenente le cellule non marcate.
- Lavare la colonna LS con 3 mL di tampone MAC, raccogliendo le cellule non marcate che lo attraversano. Lavare la colonna LS altre 2 volte.
- Rimuovere la colonna LS dal separatore magnetico. Aggiungere 5 mL di tampone MAC a ciascuna colonna e sciacquare immediatamente le cellule marcate magneticamente immergendo saldamente la colonna LS in una provetta conica pulita da 15 mL.
nota: È importante eseguire un doppio isolamento delle cellule CD11c per ottenere una sospensione cellulare di elevata purezza. Pertanto, ripetere i passaggi da 3.1 a 4.5. e fare riferimento alla Figura 4 per gli standard di purezza. Questo passaggio migliora la purezza delle cellule CD11c+ al 90-95%.
- Determinare il numero di CC CD11c+ su un emocitometro utilizzando l'esclusione del blu di tripano. Diluire il campione cellulare con una diluizione 1:1 in soluzione di blu di tripano allo 0,4%.
NOTA: Le cellule non vitali saranno colorate di blu, mentre le cellule vitali rimarranno non colorate.
- Per fare ciò, riempire con cura un emocitometro con 10 μL di diluizione del campione cellulare e incubare per 1 minuto.
- Contare le celle in 4 quadrati di 1 x 1 mm2 nella camera che è stata caricata per determinare il numero di cellule vitali.
5. Trattamento in vitro ad alto contenuto di sale di DC CD11c+
- Preparare il terreno di coltura CC aggiungendo il 10% di FBS, 0,1 mM di HEPES, 1 mM di piruvato di sodio, 50 μM di β-mercaptoetanolo e l'1% di penicillina/streptomicina a 500 mL di 1640 RPMI.
- Preparare 10 terreni di coltura cellulare ad alto contenuto di sale CC (400 mM) pesando 1,17 g di NaCl e inserendoli in una provetta sterile da 50 mL di falco. Aggiungere 50 mL di terreno di coltura cellulare DC sterile (preparato nella fase 5.1) alla provetta Falcon da 50 mL e agitare fino a quando il NaCl non è in soluzione.
- Filtrare immediatamente i terreni di coltura CC ad alto contenuto di sale utilizzando la filtrazione sottovuoto attraverso un filtro da 0,2 μm in una cappa di coltura cellulare.
- Centrifugare ogni sospensione cellulare dalla milza a 300 x g per 10 minuti a 4ºC. Risospendere ogni pellet cellulare in terreni di coltura CC a una concentrazione di 1 x 106 cellule/mL.
- Pipettare 900 μl (circa 1 x 106 cellule) di sospensione CC in una piastra Falcon a fondo piatto a 24 pozzetti. Aggiungere 100 μl di terreno di coltura CC ad alto contenuto di sale in ciascun pozzetto per una concentrazione finale di sodio di 190 mM. Etichettare la piastra e metterla in un incubatore aCO2 umificato a 37 °C per 48 ore.
6. Trasferimento adottivo di DC CD11c+ trattati con alto contenuto di sale
- Dopo la stimolazione in vitro per 48 ore, rimuovere la piastra dall'incubatore di CO2 umificato a 37 °C.
- Pipettare il terreno di coltura cellulare su e giù per risospendere le DC CD11c+. Pipettare tutta la sospensione DC CD11c+ in una provetta da 1,6 mL etichettata corrispondente. Ripetere questo passaggio per ogni singolo pozzetto impiattato.
- Centrifugare ciascuna sospensione di CD11c+ DC a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet CC con 100 μL di dPBS sterile.
- Aspirare la sospensione CC in una siringa da 1 mL dotata di un ago da 27 G e 1/2 pollice.
- Posizionare i topi maschi C57bl/6 di 10 settimane sotto il 2% di isoflurano per ottenere un piano chirurgico stabile. Controllare il livello di anestesia con la mancanza di riflesso del pedale. Una volta raggiunto un piano chirurgico stabile, introdurre lentamente e con attenzione l'ago nello spazio retroorbitale con un angolo di circa 30°.
nota: Lo smusso dell'ago da 27 G deve essere rivolto verso il basso, lontano dall'occhio, per evitare danni oculari.
- Iniettare lentamente e dolcemente la sospensione CD11c+ DC (circa 1 x 106 cellule). Una volta completata l'iniezione, rimuovere con cautela l'ago dallo spazio retro-orbitale facendo attenzione a non danneggiare l'occhio.
nota: Dopo l'iniezione, il sanguinamento dovrebbe essere minimo o nullo. Il trasferimento adottivo di DC CD11c+ può essere effettuato anche utilizzando un metodo di iniezione endovenosa (ad es. vena caudale). I topi di controllo hanno ricevuto DC CD11c+ che sono state coltivate in normali terreni salini.
- Rimuovere i topi dal cono nasale e monitorarli per circa 30 minuti durante il recupero dall'anestesia.