Imaging di cellule beta transgeniche in un topo immunodeficiente sfidato con splenociti diabetici

Abstract

Fonte: Stewart, T. et al., Monitoraggio bioluminescente della sopravvivenza del trapianto in un modello di trasferimento adottivo del diabete autoimmune nei topi.J. Vis. Exp. (2022)

Questo video dimostra un metodo basato sull'imaging per visualizzare le cellule beta trapiantate che esprimono luciferasi in un topo diabetico immunodeficiente non obeso. L'introduzione di splenociti da un topo diabetico porta alla progressiva distruzione delle cellule beta, confermata visivamente dal calo della luminescenza dopo l'introduzione del substrato.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Ingegneria e manutenzione di linee cellulari NIT-1

1. Mantenere le linee cellulari NIT-1, che condividono un background genetico con i topi diabetici non obesi (NOD), e le cellule 293FT in piastre trattate con coltura tissutale nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco contenente 4,5 g/L di glucosio integrato con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina/streptomicina in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂.
2. Far crescere le celle 293FT al 70%-80% di confluenza per la trasfezione.
3. Per ogni piatto di 10 cm di cellule 293FT, combinare 10 μg di pLenti-luciferasi-blast (vedi File supplementare 1), che esprime il transgene della luciferasi della lucciola (luc2) sotto il controllo del promotore EF1α costitutivamente attivo, 2 μg ciascuno dei plasmidi di imballaggio pMD2.G, pMDLg/pRRE e pRSV-Rev, 4 μg del plasmide della proteina dell'involucro pCMV-VSV-G, e 60 μg di polietilenimmina lineare (PEI) in 1 mL di DMEM privo di siero. Regolare le quantità in base al numero di celle da trasfettare.
4. Lasciare il DNA, il PEI e il DMEM a temperatura ambiente (RT) per 20 minuti, quindi aggiungerli alle celle 293FT.
5. Raccogliere il terreno contenente le particelle lentivirali 48 ore dopo la trasfezione.
6. Trasdurre le cellule NIT-1 a ~80% di confluenza con 1 mL di terreno contenente particelle lentivirali per 10⁶ cellule per 48-72 ore.
7. Selezionare le cellule che esprimono luciferasi con 5 μg/mL di blasticidina per 48 ore.
8. Inoltre, modificare geneticamente le cellule che esprimono luciferasi per adattarle alla domanda sperimentale. Includere una linea cellulare di controllo wild-type o non bersaglio che esprime luciferasi per il confronto.
   nota: Esempi di modifiche geniche bersaglio includono knockout di brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR), CRISPRa/i, knockdown di shRNA e sovraespressione.

2. Preparazione delle cellule NIT-1 per il trapianto

1. Far crescere le cellule che esprimono luciferasi fino a quando non sono confluenti all'80%-90%.
2. Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, 5 mL per una piastra di 10 cm).
3. Aggiungere 1 mL di acido tripsin-etilendiamminotetraacetico allo 0,05% (tripsina-EDTA) a ciascun piatto per 2 minuti.
4. Neutralizzare la tripsina con 5 ml di terreno di coltura.
5. Utilizzare una pipetta per lavare le cellule dal piatto e trasferirle in una provetta conica.
   nota: Le cellule di più piastre della stessa linea cellulare possono essere combinate.
6. Contare le cellule utilizzando un colorante come il blu di tripano manualmente con un emocitometro o automaticamente con un contatore automatico di cellule.
7. Centrifugare a 250 × g per 5 minuti a RT e rimuovere il surnatante con una pipetta aspirante.
8. Risospendere il pellet cellulare in PBS a una concentrazione di 5 × 10⁷ cellule/mL (10⁷ cellule per linea cellulare per topo saranno trapiantate in un volume di 200 μL).
9. Mantenere le cellule in ghiaccio (per un massimo di 3 ore) fino al trapianto.

3. Trapianto di cellule NIT-1 in topi non obesi con immunodeficienza combinata diabetica-grave immunodeficienza (NOD-scid)

1. Anestetizzare i topi riceventi (topi NOD-scid di 8-10 settimane dello stesso sesso dei topi usati per isolare gli splenociti) mediante inalazione di isoflurano in una camera knockdown. Erogare il 2,5% di isoflurano nella camera a una portata di 1,5 L/min e una velocità di evacuazione di 9 L/min.
2. Lubrificare gli occhi dell'animale con un unguento oftalmico per evitare che si secchi.
3. Utilizzando un rasoio elettrico con protezione, rimuovere i peli dalla parte posteriore (lato dorsale) dei topi per esporre la pelle. L'area di trapianto rasata sarà di circa 1 pollice x 2 pollici. Rimetti i topi rasati nella camera di abbattimento fino al trapianto.
4. Trasferisci i topi uno alla volta su una superficie pulita con un cono nasale di isoflurano. Guidare delicatamente la testa del mouse nel cono del naso. Utilizzare una portata di isoflurano di 0,25 L/min per mantenere l'anestesia durante il trapianto.
5. Pulisci l'area del trapianto con un tampone per la preparazione dell'alcol isopropilico per rimuovere i peli sciolti e disinfettare la pelle.
6. Assicurarsi che le cellule siano completamente risospese prima di caricare la siringa. Aspirare un volume in eccesso (>300 μL) di cellule in una siringa sterile da 1 mL con un ago da 26 G. Rimuovere eventuali bolle; quindi rimettere le cellule in eccesso nella provetta in modo che nella siringa rimangano 300 μl di sospensione cellulare.
7. Usando un paio di pinze curve tenute nella mano non dominante, sollevare delicatamente la pelle su un lato (sinistro o destro) della schiena del topo per consentire un più facile accesso allo spazio sottocutaneo.
8. Usando la mano dominante, posizionare la siringa parallelamente ai piani coronale e sagittale del corpo del topo. Con l'ago puntato verso la testa del topo, inserire l'ago nella pelle vicino ai quarti posteriori e guidarlo delicatamente nello spazio sottocutaneo. Assicurarsi che l'intero ago rimanga sotto la pelle e non fuoriesca.
9. Regola la pinza per tenere delicatamente la pelle attorno alla base dell'ago. Erogare lentamente una piccola quantità di sospensione cellulare (<50 μL) e verificare che si formi un piccolo rigonfiamento sotto la pelle nel sito dell'iniezione. Continuare a iniettare la sospensione cellulare fino a quando non sono stati erogati 200 μL nello spazio sottocutaneo.
10. Tenendo la pinza in posizione e mantenendo l'ago parallelo al corpo del topo, estrarre lentamente l'ago. Dopo che l'ago è stato rimosso, tenere la pelle chiusa con una pinza per alcuni secondi per evitare che le cellule fuoriescano dalla ferita da puntura.
11. Se si sta valutando una modificazione genetica, ripetere il trapianto sul lato opposto del topo utilizzando una siringa diversa in modo che sia le cellule mutanti che quelle di controllo vengano iniettate in ciascun topo, con una linea cellulare a sinistra e l'altra a destra. Se viene trapiantata una sola linea cellulare, iniettare le cellule su un solo lato.
12. Dopo il trapianto, trasferisci ogni topo in una gabbia nuova. Consenti a ciascun topo di riprendersi completamente dall'anestesia prima di aggiungere altri topi alla gabbia.
    nota: I topi si riprendono quando riprendono le normali attività e non mostrano segni di letargia o alterazione del movimento.
13. Valutare quotidianamente lo stato di salute dei topi per tutta la durata dell'esperimento successivo al trapianto. Se gli innesti formano un grande rigonfiamento o i topi diventano deboli e letargici, misurare la glicemia e fornire il 10% (p/p) di acqua saccarosio ad libitum a tutti i topi ipoglicemici. Segui tutte le raccomandazioni veterinarie e sopprimi tutti i topi con continue cattive condizioni corporee secondo le linee guida istituzionali. In questo studio, i topi sono stati soppressi mediante inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale.

4. Isolamento e purificazione degli splenociti autoreattivi

1. Identificare i topi NOD maschi o femmine di 10-16 settimane con diabete di recente insorgenza (meno di 10 giorni) utilizzando strisce reattive per la glicemia nelle urine (o nel sangue). I topi NOD sono considerati diabetici quando hanno una glicemia nelle urine/sangue ≥250 mg/dL per almeno 2 giorni consecutivi.
   nota: Per ogni topo NOD-scid sono necessari 10 milioni di splenociti; Una milza produce tipicamente da 50 a 150 milioni di splenociti. Gli splenociti sono stati isolati da topi privi di agenti patogeni ospitati in una struttura monitorata dal senziale.
2. Eutanasia il numero appropriato di topi diabetici NOD.
   nota: In questo studio, i topi sono stati soppressi mediante inalazione di CO₂ seguita da lussazione cervicale per garantire la morte.
3. Con il mouse sul dorso, praticare un'incisione verticale di circa 2 pollici di lunghezza nella pelle con le forbici chirurgiche. Apri il lato destro del mouse dal punto di vista del ricercatore e individua la milza rosso vivo. Tagliare delicatamente la milza dal pancreas rosa e trasferirla in una piastra di Petri sterile da 10 cm contenente 5 ml di PBS sterile. Ripeti la dissezione con tutti i topi necessari.
   nota: Le milze di più topi possono essere combinate in un piatto. Eseguire i seguenti passaggi utilizzando reagenti e apparecchiature sterili in una cappa sterile.
4. Schiacciare la milza o le milze con la parte superiore piatta di uno stantuffo sterile per siringa.
5. Posizionare un colino da 40 μm o 70 μm in una provetta conica da 50 mL e lavare il colino con 5 mL di PBS per adescarlo. Trasferire la sospensione della milza nel colino e continuare a schiacciare delicatamente il colino. Lavare la pirofila con 10 ml di PBS e trasferire il lavaggio nel colino. Continuate a schiacciare fino a quando il colore rosso non sarà scomparso dal colino.
6. Gettare il colino e centrifugare la provetta a 500 × g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante con una pipetta di aspirazione.
7. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL (per un massimo di tre milze) di tampone di lisi ACK preriscaldato a RT e lisare i globuli rossi per 4 minuti. Aumentare il volume di 1-2 mL per milza se sono necessarie ulteriori milze.
8. Arrestare la reazione con 5 mL di terreno cellulare NIT-1 (descritto sopra) per 5 mL di tampone di lisi. Passare la sospensione cellulare attraverso un colino fresco per rimuovere i grumi. Scartare il colino e centrifugare a 500 × g per 5 minuti a RT.
9. Risospendere il pellet cellulare in 20 mL di PBS e contare le cellule. Centrifugare a 500 × g per 5 minuti a RT. Risospendere le cellule in PBS sterile a una concentrazione di 1 × 10⁸ cellule/mL (il volume di iniezione è 0,1 mL/topo) in una provetta di reazione safe-lock da 1,5 mL.
10. Conservare le cellule in ghiaccio (per non più di 1 ora) o tenere le cellule in RT e procedere immediatamente all'iniezione della vena caudale.

5. Iniezione endovenosa di splenociti diabetici attraverso la vena caudale laterale

1. Riscaldare il corpo dei topi adulti riceventi NOD-scid (ad esempio, utilizzando una lampada termica per ~5-10 minuti) per vasodilatare le vene (questo aiuta per la visualizzazione e l'iniezione nella vena).
   nota: Per evitare il surriscaldamento dei topi, non superare questo tempo. Monitorare sempre lo stato di salute. Se i mouse appaiono esausti o immobili, spegnere immediatamente la lampada termica.
2. Riscaldare la sospensione della cella. Preparare una siringa sterile (0,3-1,0 ml) con un ago sterile (27-30 g, 0,3 mm/0,5 pollici o più piccolo) oppure utilizzare una siringa da insulina sterile da 0,5 ml con un ago da 0,3 mm (0,5 pollici). Mantenere sempre l'ago sterile e utilizzare un vassoio sterile se la siringa deve essere posata tra un'iniezione e l'altra.
3. Risospendere la soluzione di splenociti prima di ogni iniezione. Per ogni topo, aspirare 100 μl della sospensione di splenociti preriscaldata e miscelata nella siringa. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nella siringa o nella sospensione.
   nota: Assicurarsi di avere tutte le attrezzature e le forniture preparate (salviettine imbevute di alcol per la disinfezione, una siringa caricata con gli splenociti da iniettare e una nuova gabbia per separare i topi iniettati) prima di posizionare il topo nel dispositivo di contenzione.
4. Posizionare il mouse nel dispositivo di ritenuta. Cattura la coda con la mano non dominante e individua una delle due vene laterali della coda. Ruotare delicatamente la coda se necessario. Pulire la coda con una salvietta disinfettante (alcol isopropilico al 70%) per pulire la pelle e aumentare la visibilità della vena.
5. Inserire l'ago ad angolo acuto nella regione centrale della coda con la mano dominante. Con lo smusso dell'ago rivolto verso l'alto, far scorrere l'ago di alcuni millimetri attraverso la pelle.
   nota: Assicurarsi che l'ago sia parallelo alla vena e posizionato leggermente sotto la pelle. Preparati a movimenti improvvisi del topo/della coda subito dopo essere penetrato nella parete della pelle/del vaso. Un inserimento riuscito dell'ago dovrebbe essere percepito come uno "scivolamento regolare" nella vena. Se è necessario un altro tentativo, spostati più in alto nella coda verso il corpo.
6. Applicare una leggera pressione sulla siringa per iniettare la sospensione di splenociti. Non lasciare che l'ago si muova ulteriormente verso l'interno o verso l'esterno durante l'iniezione. Le iniezioni riuscite sono fluide senza avvertire alcuna contropressione durante l'iniezione e sono indicate da un flusso sanguigno trasparente/bianco immediatamente dopo l'iniezione.
7. Rilasciare delicatamente l'ago dalla vena e applicare una leggera pressione sulla coda con una salvietta disinfettante fino a quando l'emorragia non si ferma. Rilasciare il mouse dal dispositivo di ritenuta e trasferirlo delicatamente in una gabbia appena preparata.
   nota: Iniettare due o tre topi di controllo che non ricevono un trapianto di cellule NIT-1 con splenociti per confermare il potenziale degli splenociti autoreattivi di indurre il diabete, che richiede circa 2-4 settimane dopo l'iniezione.

6. Imaging bioluminescente in vivo di innesti NIT-1

NOTA: Immagine gli innesti una o due volte a settimana. Il giorno del trapianto, attendere almeno 2 ore dopo il trapianto per consentire agli innesti di stabilizzarsi e garantire un'espressione stabile della luciferasi. Se il tempo è un fattore limitante, la misurazione iniziale può essere effettuata il giorno 1. Un programma di imaging iniziale raccomandato è il giorno 0 o il giorno 1 dopo l'iniezione, il giorno 5, il giorno 10, il giorno 14, il giorno 18 e il giorno 25. Regolare il programma, tuttavia, in base al progresso dell'autoimmunità come giudicato dalla perdita del segnale bioluminescente.

1. Preparare una soluzione di D-luciferina da 15 mg/mL nel PBS di Dulbecco. Agitare a RT per sciogliere e filtrare in modo sterile (0,22 μm). Conservare 1 mL di aliquote a -20 °C e scongelare secondo necessità.
   nota: Le aliquote possono essere ricongelate.
2. Almeno 5 minuti prima dell'imaging, iniettare i topi per via intraperitoneale utilizzando una siringa da 1 ml e un ago da 26 G con soluzione di D-luciferina alla dose di 150 mg/kg.
   nota: Utilizzare una siringa e un ago nuovi per ogni topo.
3. Anestetizzare i topi mediante inalazione di isoflurano secondo le linee guida istituzionali. Le condizioni raccomandate sono isoflurano al 2,5% con una portata di 1,5 L/min nella camera di abbattimento e una velocità di evacuazione di 9 L/min.
4. Lubrificare gli occhi dell'animale con un unguento oftalmico per evitare che si secchi.
5. Aprire il software associato allo strumento di imaging. Crea un nuovo utente e/o accedi. Nel pannello di controllo in basso a destra, selezionare Inizializza (Figura 1A). Per salvare automaticamente i dati di imaging, creare le cartelle appropriate sul computer, quindi selezionare Acquisizione | Salvataggio automatico in... (Figura 1A). Una volta terminata l'inizializzazione dello strumento, impostare il tempo di esposizione su 1 min.
   nota: I parametri di imaging completi sono mostrati nella Figura 1B.
6. Trasferire i mouse uno alla volta dalla camera di smontaggio allo strumento di imaging. Posiziona il topo a pancia in giù con gli arti divaricati e guida delicatamente la testa nel cono del naso. Una portata di isoflurano di 0,25 L/min erogata attraverso un cono nasale è appropriata per mantenere l'anestesia durante l'imaging. Appiattisci delicatamente il mouse premendo il centro della schiena con entrambe le mani e poi allargando le mani verso l'esterno e divaricate.
7. Selezionare Acquisisci (Figura 1B). Registrare tutti i dettagli rilevanti dell'esperimento nella finestra pop-up (Figura 1C).
   nota: Vedere la Figura 2A per immagini rappresentative di tre topi femmina NOD-scid di 8 settimane trapiantati con due innesti in vari punti temporali.

Risultati

Figura 1: Screenshot dei comandi software per l'imaging di innesti bioluminescenti. (A) Prima dell'imaging, selezionare Inizializza per preparare lo strumento. Le immagini possono essere salvate automaticamente in una cartella a scelta selezionando Acquisizione | Salvataggio automatico in... (B) Panoramica dei parame...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,05% tripsina, 0,53 mM EDTA	Corning	25-052-CI
293FT	Invitrogen	R70007	Isolato clonale a crescita rapida e altamente trasfecabile derivato da cellule renali embrionali umane trasformate con l'antigene T grande SV40
ACK Tampone di lisi	Gibco	Codice A10492-01
Tamponi per la preparazione dell'alcol, 70% alcol isopropilico	Amazon/Pronto Soccorso Ever Ready	B08NWF31DX
BD 5ml Siringa Luer-Lok Punta	Bd	309646
Ago BD PrecisionGlide 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q	Bd	305115
BD 1 mL TB Siringa Slip Tip	Bd	309659
Blasticidina S HCl	Corning	30-100-RB
Filtro cellulare premium SureStrain, 70 μm, sterile	Articoli da laboratorio meridionali	Visualizzazione del materiale C4070	Oppure utilizzare un colino sterile simile con pori di 40-70um
Contatore di celle automatizzato CellDrop	Denovix	CellDrop BF-PAYG	Oppure utilizzare un dispositivo contatore di celle simile
Corning 100 mL Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x	Corning	30-002-CI
Pipette di aspirazione monouso, polistirene, sterili, capacità=2 mL	VWR	Codice 414004-265	Oppure utilizzare una pipetta di aspirazione simile
D-luciferina, sale di potassio, grado di biologia molecolare, polvere, >99%	Goldbio	FORTUNA-100
DMEM, glucosio alto, piruvato, senza glutammina	Gibco	10313039
Provette Falcon BD, 50 mL	Fisher Scientifico	14-959-49A
Siero fetale bovino	Gibco	Codice 10437-028
Pinze premium per tessuti, 1 x 2 denti 5 pollici, acciaio tedesco	Fisher Scientifico	13-820-074
Striscia reattiva per urine di glucosio	Farmacia per animali domestici della California	u-TSG100	Oppure utilizzare una striscia reattiva simile per la misurazione del glucosio nelle urine/sangue
GlutaMAX–1 (100x)	Gibco	Codice 35050-061
Lampada riscaldante a infrarossi	Cole Parmer	Codice 03057-00	Oppure utilizzare una lampada a infrarossi simile
Siringa da insulina 0,5 mL, U-100 29 G 0,5 in	Becton Dickinson	309306
Isoflurano, USP	Piramal Terapia Intensiva	6679401725
Sistema di imaging in vivo IVIS Spectrum	Perkin Elmer	124262	Strumento per la raccolta non invasiva di immagini bioluminescenti di cellule trapiantate
Software di analisi delle immagini viventi	Perkin Elmer	128113	Software per la raccolta e la quantificazione del segnale bioluminescente
Provette per microcentrifuga seal-rite, 1,5 mL	Stati Uniti d'America Scientific	Codice 1615-5510	Oppure utilizzare provette sterili per microcentrifuga simili
NIT-1	ATCC	CRL-2055	Linea beta-cellulare pancreatica derivata da topi NOD/Lt
annuire. Cg-Prkdcscid/J	Il laboratorio Jackson	Anno 1303	I topi omozigoti per la mutazione spontanea grave di immunodeficienza combinata Prkdcscid, comunemente indicata come scid, sono caratterizzati da assenza di cellule T e cellule B funzionali, linfopenia, ipogammaglobulinemia e un normale microambiente ematopoietico.
NOD/ShiLtJ	Il laboratorio Jackson	Anno 1976	Il ceppo di topi NOD/ShiLtJ (comunemente chiamato NOD) è un modello poligenico per il diabete autoimmune di tipo 1
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher Scientifico	10010031	Senza calcio, senza magnesio, senza rosso fenolo
pCMV-VSV-G	Addgene	Codice: 8454
pLenti-luciferasi-blasto	Realizzato internamente	Plasmide disponibile su richiesta	Vedere il file supplementare 1
pMD2.G	Addgene	Codice: 12259
pMDLg/pRRE	Addgene	Codice: 12251
Polietilenimmina, lineare, MW 25.000, grado di trasfezione (PEI 25K)	Fisher Scientifico	NC1014320
pRSV-Rev	Addgene	Codice: 12253
Fermaglio per roditori, rotondo a scopa da 1 pollice	Fisher Scientifico	01-288-32A
Forbici a punta acuminata	Fisher Scientifico	08-940	Oppure usa altre forbici in acciaio inossidabile chirurgico
Piastre di coltura trattate con coltura tissutale	Millipore Sigma	CLS430167-20EA	Oppure utilizzare altre piastre di Petri sterili trattate con colture cellulari
Pinzette/Pinze, precisione fine a punta media	Fisher Scientifico	12-000-157