Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Materiali e reagenti
- Utilizzare zanzare femmina di Anopheles stephensi (ceppo Sda500) che si nutrono di topi infetti 3-5 giorni dopo l'emergenza e allevano come descritto in precedenza.
- Utilizzare il clone del Plasmodium berghei ANKA che esprime il gene della proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore costitutivo della proteina da shock termico 70 (HSP70). Ciò produce una fluorescenza brillante per tutto il ciclo di vita del parassita.
- Utilizzare topi femmina C57BL/6JRj (7 settimane).
nota: Tutti i reagenti utilizzati nel protocollo descritto sono elencati nella schedaMateriali/Attrezzature.
2. Isolamento di Sporozoite Attenuato dalle Radiazioni dalle Ghiandole Salivari delle Zanzare
- Tra 18-25 giorni dopo il pasto di sangue infettivo, raccogliere e anestetizzare a freddo le zanzare in un tubo da 15 ml su ghiaccio come descritto in precedenza. Trasferirli con cura su una capsula di Petri capovolgendo il tubo. Mantieni gli insetti sul ghiaccio ed esponi le zanzare a una dose di 12 krad di irradiazione γ o x.
- Isolare gli sporozoiti attenuati dalle ghiandole salivari irradiate dalle zanzare come descritto in precedenza. Raccogliere le ghiandole salivari infette in un piccolo volume (circa 15 μl) di soluzione salina tamponata con fosfato di 1x Dulbco (DPBS) su ghiaccio e schiacciarle delicatamente per rilasciare sporozoiti.
nota: Poiché l'iniezione di una sospensione antiparassitaria altamente concentrata in un piccolo volume è fondamentale, è quindi essenziale prelevare un numero sufficiente di ghiandole salivari da un numero elevato di zanzare ben infette preselezionate, come evidenziato dalla loro robusta espressione di fluorescenza verde.
- Filtrare la sospensione di sporozoite attraverso un tappo filtrante da 35 μm adattato a una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml a bassa adesione per eliminare grumi e detriti di zanzare.
- Contare il numero totale di sporozoiti isolati come descritto in precedenza e regolare la concentrazione di sospensione di parassiti con 1x DPBS a freddo per ottenere 83.000 sporozoiti/μl. Conservare i parassiti su ghiaccio mentre si continuano i passaggi successivi.
- Raccogliere il numero equivalente di ghiandole salivari da zanzare non infette che verranno utilizzate come controllo negativo ed elaborare il campione come descritto nei passaggi 2.2 e 2.3. Diluire il campione come indicato sopra per ottenere una concentrazione simile di estratti di ghiandole salivari nella sospensione.
nota: Gli sporozoiti possono essere conservati con ghiaccio per un massimo di 2 ore. Tuttavia, idealmente vengono iniettati entro un'ora dalla frantumazione delle ghiandole salivari.
3. Iniezione di Sporozoiti nello strato dermico dell'orecchio
- Anestetizzare gli animali mediante iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (50 mg/kg)/xilazina (5 mg/kg). Attendere 5-8 minuti affinché il topo sia in uno stato di incoscienza e applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire l'essiccazione della cornea. Valutare la profondità dell'anestesia eseguendo un leggero pizzicamento delle dita su entrambi i piedi posteriori.
nota: La dose di anestesia dura meno di 20 minuti, quindi i passaggi successivi devono essere eseguiti rapidamente.
- Stabilizzare il padiglione auricolare del topo fissando il lato ventrale con del nastro adesivo trasparente precedentemente posizionato sotto uno stereomicroscopio (Figura 1A). Premere delicatamente l'orecchio per evitare danni al sistema vascolare.
- Caricare una siringa da 10 μl/ago smussato da 35 gauge con 0,6 μl di parassiti risospesi.
- Erogare la sospensione di sporozoite in 4 siti di iniezione (0,15 μl per sito) inserendo con cautela l'ago sul lato dorsale dell'orecchio (Figura 1A), sotto l'epidermide, con lo smusso rivolto verso l'alto, facendo attenzione a evitare vasi sanguigni. Lasciare che l'ago rimanga nel derma per alcuni secondi per evitare il riflusso dell'iniettore prima di rimuoverlo. Osservare una papula caratteristica in ogni sito di iniezione al termine della procedura (Figura 1B e 1C).
- Dopo l'iniezione, rimuovere con cautela l'orecchio dal nastro.
- Iniettare nell'orecchio controlaterale la stessa dose di parassiti seguendo i passaggi 3.2-3.4.
- Iniettare in altri 2 topi 0,6 μl di 1x DPBS o 0,6 μl di 1x DPBS + estratto di ghiandole salivari da zanzare non infette al fine di valutare la risposta infiammatoria mediata dalla sola iniezione e dalla deposizione di materiale di zanzara nel derma.
- Monitorare il recupero del topo dall'anestesia prima di rimetterlo nella gabbia.
nota: La corretta deposizione di sporozoiti nella pelle può essere monitorata mediante microscopia a fluorescenza (Figura 2A e 2B), il topo viene preparato come descritto in precedenza.
