1. Coltura di iPSC umane (hiPSC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF)
NOTA: Possono essere utilizzati anche metodi alternativi per la coltura di hiPSC, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la semina su una piastra a 6 pozzetti pre-rivestita con gelatina, una miscela di proteine gelatinose, laminina ricombinante 511 o qualsiasi altra matrice extracellulare utilizzata nell'espansione di hiPSC e coltivata utilizzando terreni definiti appositamente formulati per la coltura di cellule staminali pluripotenti umane.
- Coltura MEF
- Rivestire una capsula di Petri per colture cellulari da 10 cm con 4 mL di gelatina allo 0,1% e incubare per 30 minuti a 37 °C.
- Scongelare rapidamente una fiala di 4 x 106 MEF irradiati in 10 mL di terreno MEF a 37 °C (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM] + 10% di siero fetale bovino (FBS) + 1x penicillina-streptomicina + 1x integratore di L-glutammina). Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 9 mL di terreno MEF.
- Togliere la capsula ricoperta di gelatina dall'incubatrice. Aspirare la gelatina e aggiungere 7 ml di terreno MEF. Preparare 3 mL di sospensione di MEF (dal punto 1.1.2) sulla capsula rivestita di gelatina. Scuotere il piatto da un lato all'altro e dalla parte anteriore a quella posteriore per garantire una distribuzione uniforme del MEF sul piatto. Incubare a 37 °C per 8-36 h.
- Superamento di hiPSC su MEF
NOTA: I dati sono stati generati utilizzando l'antigene del melanoma riconosciuto dalle cellule T 1 (MART-1) iPSC derivato da un linfocita infiltrante il tumore (TIL) in coltura a lungo termine, che riconosce specificamente il peptide MART-1 nel contesto dell'antigene leucocitario umano (HLA)-A*02:01.
- Passaggio hiPSC quando le colonie hanno un diametro compreso tra 0,8 e 1,2 mm. Prima del passaggio, controllare le colonie di hiPSC in uno stereomicroscopio e rimuovere eventuali aree di differenziazione dalla coltura utilizzando il bordo di plastica di un puntale da 200 μl.
- Aspirare il terreno esaurito e aggiungere 10 mL di terreno hiPSC (terreno di coltura di cellule staminali embrionali umane [ES] [Tabella dei materiali] + 10 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti basici umani [hbFGF]) integrati con 10 μM di inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK).
- Tenere la piastra per colture cellulari in una mano e far rotolare uno strumento di passaggio cellulare usa e getta su tutta la piastra in una direzione. Applicare una pressione sufficiente in modo che l'intera lama del rullo tocchi la piastra di coltura e mantenga una pressione uniforme durante l'azione di rotolamento.
- Ruotare il piatto di coltura di 90° e ripetere il passaggio 1.2.3. Visualizza la piastra al microscopio per confermare visivamente il corretto taglio delle colonie, che dovrebbero apparire a scacchi. Staccare le colonie tagliate mediante lavaggio meccanico delicato con una pipetta da 200 μl.
nota: Il distacco delle colonie tagliate mediante lavaggio meccanico deve essere effettuato immediatamente dopo il taglio delle colonie con il rullo perché dopo 3 minuti le colonie tagliate inizieranno a riattaccarsi al piatto e diventerà difficile staccare colonie di dimensioni omogenee mediante lavaggio.
- Trasferire 350 - 600 grumi di colonie tagliate su un nuovo piatto di 10 cm di MEF (placcato 8 - 36 ore prima del passaggio hiPSC) con 10 mL di terreno hiPSC fresco integrato con 10 μM di inibitore ROCK. Incubare a 37 °C.
NOTA: 600 grumi rappresentano circa 1,0 x 106 MART-1 iPSC e produrranno 0,5-1,0 x 106 cellule DP il giorno 35. Tuttavia, i numeri previsti varieranno a seconda della potenza della linea cellulare di partenza e delle condizioni di coltura.
- Il giorno seguente, aspirare il terreno esaurito e aggiungere 10 ml di terreno hiPSC fresco. Sostituire il terreno hiPSC ogni 1-2 giorni, a seconda del tasso di crescita dell'hiPSC.
2. Preparazione di cellule OP9/DLL1 per la co-coltura con hiPSC
- Coltura di cellule OP9/DLL1 in terreno OP9 [α terreno essenziale minimo (α-MEM) + 20% di siero fetale bovino (FBS) + 1x penicillina-streptomicina] a 37 °C. Quando le cellule OP9/DLL1 raggiungono la confluenza, aspirare il terreno e lavare una volta con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) priva di magnesio, calcio e fenolo.
- Aspirare il PBS e aggiungere 2 ml di acido tripsin-etilendiamminotetraacetico allo 0,05% (EDTA). Incubare per 5 minuti a 37 °C. Quindi, aggiungere 4 mL di terreno OP9 e dissociare meccanicamente lo strato cellulare mediante pipettaggio per ottenere una sospensione a cellula singola.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL attraverso un filtro cellulare da 100 μm per evitare la formazione di grumi cellulari. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere in 12 mL di terreno OP9.
- Aggiungere 8 mL di terreno OP9 a sei nuove piastre Petri per colture cellulari da 10 cm. Piastra 2 mL di sospensione cellulare OP9/DLL1 dal passaggio 2.3 su ogni nuova piastra da 10 cm. Scuotere il piatto da un lato all'altro e poi dalla parte anteriore a quella posteriore per garantire una distribuzione uniforme di OP9/DLL1 sul piatto.
- Incubare a 37 °C. Ripetere il passaggio ogni 2 - 3 giorni quando le cellule raggiungono la confluenza.
nota: È importante preparare una quantità sufficiente di celle congelate OP9/DLL1 e scongelare una nuova scorta ogni 4-6 settimane.
3. Differenziazione in vitro di hiPSC in cellule T CD8αβ+ singole positive (SP)
- Preparare i piatti gelatinizzati OP9/DLL1 una settimana prima della co-coltura con le hiPSC. Per preparare una soluzione di gelatina allo 0,1%, aggiungere 5 mL di soluzione madre di gelatina tissutale a temperatura ambiente (RT) a 500 mL di PBS.
- Rivestire 3 nuove piastre di Petri per colture cellulari da 10 cm aggiungendo 4 ml per capsula di gelatina allo 0,1%. Incubare 30 minuti a 37 °C.
- Aspirare la gelatina e aggiungere 8 ml di terreno OP9 a ciascun piatto. Passaggio di una piastra confluente di OP9/DLL1 (come fatto nella sezione 2 sopra) a tre piastre pre-rivestite di gelatina.
- Dopo 4 giorni, aggiungere 10 mL di terreno OP9 a ciascuna piastra da 10 cm di OP9/DLL1 su gelatina per 20 mL di terreno per piastra.
- Dopo 7-8 giorni, iniziare la co-coltura hiPSC su piastre confluenti OP9/DLL1 (giorno 0 di differenziazione).
- Aspirare il fluido esausto da una piastra confluente di 10 cm di hiPSC su MEF. Aggiungere 10 mL di terreno OP9. Tagliare e staccare le colonie di hiPSC utilizzando uno strumento di passaggio cellulare monouso, come fatto nei passaggi 1.2.3 e 1.2.4.
- Trasferire 350 - 600 grumi di colonie tagliate su una piastra OP9/DLL1 pregelatinizzata da 10 cm (passaggio 3.1) con 10 mL di terreno OP9 fresco utilizzando una pipetta da 200 μL. Scuotere il piatto di coltura da un lato all'altro e poi dalla parte anteriore a quella posteriore per garantire una distribuzione uniforme delle colonie.
nota: In alternativa, possono essere utilizzati corpi embrioidi (EB) hiPSC preformati o piccole sospensioni a grumo. Tuttavia, l'utilizzo di uno strumento di passaggio cellulare monouso o di un sistema di formazione EB è preferibile per produrre grumi di hiPSC di dimensioni uniformi.
- Il giorno 1, aspirare il terreno esaurito e sostituirlo con 20 mL di terreno OP9 fresco. I grumi di hiPSC co-coltivati su OP9/DLL1 per 1 giorno appariranno come piccole colonie rotonde monostrato (Figura 1).
- Il giorno 5, aspirare 10 mL di terreno esaurito e aggiungere 10 mL di terreno OP9 fresco. Le colonie di hiPSC inizieranno a differenziarsi in mesoderma primitivo, caratterizzato da un centro scuro multistrato.
- Il giorno 9, aspirare 10 mL di terreno esaurito e aggiungere 10 mL di terreno OP9 fresco. A questo punto, le strutture centrali multistrato si evolveranno in forme a cupola e diventerà evidente un'area periferica simile a una rete.
- Il giorno 13, raccogliere le cellule progenitrici ematopoietiche (HPC) (Figura 1). Le strutture derivate da hiPSC il giorno 13 sono caratterizzate da un organoide centrale scuro circondato da una rete di aree a forma di cupola, rappresentative delle zone ematopoietiche (HZ) precedentemente riportate per racchiudere progenitori ematopoietici derivati da cellule staminali embrionali umane.
NOTA: La presenza di strutture a cupola indica un processo di successo anche in assenza di centri scuri. L'incapacità di produrre HPC può essere dovuta alla scarsa qualità di OP9/DLL1, alla qualità del lotto FBS, alla confluenza di aggregati di iPSC seminati su OP9/DLL1 (350-600 aggregati è ottimale) e/o alle variazioni nella potenza delle linee di iPSC per produrre precursori ematopoietici.
- Aspirare il terreno esausto e lavare 1 volta con 5 ml di 1 soluzione salina bilanciata di Hanks priva di rosso fenolo modificata con calcio e magnesio (HBSS).
- Aspirare HBSS e aggiungere 250 μL di 5000 unità/mL di collagenasi IV in 10 mL di HBSS. Incubare a 37 °C per 45 min. Aspirare HBSS con collagenasi IV e lavare una volta con 5 ml di PBS.
- Aspirare il PBS e aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,25%. Incubare a 37 °C per 20 min. Quindi, aggiungere 4 mL di terreno OP9 e dissociare lo strato cellulare mediante pipettaggio per ottenere una sospensione a cellula singola.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL attraverso un filtro cellulare da 100 μm. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere in 10 mL di terreno OP9.
- Piastra in sospensione cellulare su una nuova piastra di Petri gelatinizzata da 10 cm per colture cellulari (vedere i passaggi 3.1.1 e 3.1.2). Incubare a 37 °C per 45 min. Quindi, raccogliere le cellule non aderenti mediante pipettaggio delicato.
- Trasferire la sospensione cellulare raccolta in una provetta conica da 50 mL attraverso un filtro cellulare da 100 μm. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere in 10 mL di terreno di differenziazione [terreno OP9 con 5 ng/mL di fattore di cellule staminali umane (hSCF), 5 ng/mL di ligando Flt3 umano (hFLT3L) e 5 ng/mL di interleuchina umana 7 (hIL-7)].
- Placcare la sospensione cellulare su una nuova piastra confluente OP9/DLL1 da 10 cm.
- Il giorno 16, passaggio delle celle.
- Staccare meccanicamente le cellule non aderenti mediante pipettaggio delicato e filtrare attraverso un filtro cellulare da 100 μm. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare il surnatante e risospendere in 10 mL di terreno di differenziazione.
- Placcare la sospensione cellulare su una nuova piastra confluente OP9/DLL1 da 10 cm.
- Successivamente continuare a passare le cellule non aderenti ogni 5-7 giorni ripetendo il passaggio 3.8.
- Il giorno 35, arricchire la popolazione CD4+CD8+ doppio positivo (DP) e stimolare la produzione di cellule T CD8αβ+ singole positive (SP) (Figura 2).
- Staccare meccanicamente le cellule non aderenti pipettandole delicatamente e filtrandole attraverso un filtro cellulare da 100 μm per rimuovere i grumi. Arricchire la popolazione cellulare CD4+ mediante l'isolamento di biglie magnetiche CD4 secondo il protocollo del produttore.
nota: Il razionale per l'utilizzo delle microsfere magnetiche CD4 è quello di rimuovere le cellule CD4-CD8-doppio negativo (DN) dalla coltura, poiché è stato dimostrato che queste causano l'uccisione diretta delle cellule CD4+CD8+ DP dopo la stimolazione.
- Contare le cellule CD4 vive arricchite utilizzando un emocitometro Neubauer e il colorante blu di tripano. Sospendere in terreno OP9 a una concentrazione totale di 0,5 x 106 cellule/mL. Aliquotare 1 mL di sospensione cellulare (0,5 x 106 cellule) in ciascun pozzetto di una coltura tissutale a fondo piatto 24 piastre sane di OP9/DLL1 confluente.
- Aggiungere 100 UI di interleuchina umana 2 (hIL-2), 5 ng/mL di hIL-7, 500 ng/mL di anticorpo CD3 umano e 2 μg/mL di anticorpo CD28 umano, quindi coltura a 37 °C.
