Generazione di singole cellule T CD8 positive da cellule staminali pluripotenti indotte

Abstract

Fonte: Good, M. L., et al. Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T antigene-specifiche tumorali. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video mostra un test per generare cellule T CD8αβ+ derivate da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) derivate da cellule T CD8αβ+ specifiche per l'antigene tumorale. Le iPSC antigene-specifiche del tumore vengono coltivate su un monostrato di cellule stromali e differenziate in cellule progenitrici ematopoietiche (HPC). Le HPC sono differenziate in cellule T CD4+ CD8+ doppiamente positive utilizzando un mezzo di differenziazione. Queste cellule vengono quindi stimolate a generare cellule T single-positive che esprimono CD8.

Protocollo

1. Coltura di iPSC umane (hiPSC) su fibroblasti embrionali di topo (MEF)

NOTA: Possono essere utilizzati anche metodi alternativi per la coltura di hiPSC, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la semina su una piastra a 6 pozzetti pre-rivestita con gelatina, una miscela di proteine gelatinose, laminina ricombinante 511 o qualsiasi altra matrice extracellulare utilizzata nell'espansione di hiPSC e coltivata utilizzando terreni definiti appositamente formulati per la coltura di cellule staminali pluripotenti umane.

1. Coltura MEF
   1. Rivestire una capsula di Pet....

Risultati

Figura 1: Generazione di cellule progenitrici ematopoietiche derivate da hiPSC. (A) Panoramica schematica della differenziazione delle hiPSC in linea ematopoietica utilizzando la co-coltura OP9/DLL1. (B) Comparsa di strutture derivate da hiPSC nei giorni 1 (in alto a sinistra), 3 (in alto a destra), 7 (in basso a sinistra) e 13 (in basso a destra). Barre della scala .......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatto da 10 cm	Corning, Inc.	353003
Anti-CD3, umano	BD Bioscienze	Gatto# 561812, RRID:AB_1089628
Anti-CD34, umano	BD Bioscienze	Gatto# 348791, RRID:AB_400381
Anti-CD4, umano	Bioleggenda	Gatto# 344612, RRID:AB_2028479
Anti-CD43, umano	BD Bioscienze	Gatto# 560198, RRID:AB_1645460
Anti-CD7, umano	BD Bioscienze	Gatto# 555361, RRID:AB_395764
Anti-CD8a, umano	BD Bioscienze	Gatto# 555369, RRID:AB_398595
Anti-CD8b, umano	BD Bioscienze	Gatto# 641057, RRID:AB_1645747
Anti-TCRb, umano	BD Bioscienze	Gatto# 555548, RRID:AB_395932
Anticorpo monoclonale umano CD28 (15E8), grado funzionale puro	Miltenyl Biotec	Codice 130-093-375
Anticorpo monoclonale umano CD3 (OKT3), grado funzionale puro	Miltenyl Biotec	Codice 130-093-387
Microsfere CD4 umane	Miltenyl Biotec	Codice 130-045-101
Filtro cellulare 100 um	Fisher Scientifico	Codice 22-363-549
Siero fetale bovino (FBS)	Gemelli	100-500
Legante Flt-3	Sistemi di ricerca e sviluppo	427-FL
Soluzione di gelatina 2%	SIGMA-Aldritch	G1393-100ML
GlutaMAX (100X)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 35050-061	Integratore di L-Glutammina
HBSS Mg+Ca+ senza rosso fenolo	Gibco	Codice 14025-092
Interleuchina-2	Sistemi di ricerca e sviluppo	202-IL
Interleuchina-7	Sistemi di ricerca e sviluppo	407-ML
iTAG MHC Tetramer HLA-A*0201 Mart1 Tetramer -ELAGIGILTV	Alessio	Gatto#TB-0009-2
Mart1-hiPSC	Vizcardo et al., Cellula staminale 2013	RIKEN-IMS
Melan-A, MART 1 (26-35)	InnoPep	Codice 3146-0100
MEM Soluzione di Aminoacidi Non Essenziali	Gibco	11140050
Polvere αMEM	Gibco	61100061
Fibroblasti embrionali di topo (MEF)	Thermo Fisher Scientifico	C57BL/6 MEF MITC-TRATTATO 4M CADAUNO; Codice: A34962
OP9/N-DLL1	Centro di biorisorse Riken	Gatto# RCB2927; RRID:CVCL_B220	OP9/DLL1
Penicillina/streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	Codice: 15140-122
Soluzione salina tamponata con fosfato pH 7,4 (1x)	Thermo Fisher Scientifico	Codice 10010-023
Terreno cellulare ES per primati	Reprocell	RCHEMD001	Cultura ESC umana Media
Inibitore di Rhok (Y-27632 dicloridrato)	Tocris	Ore 1254
RPMI 1640	Gibco	11875093
Fattore delle cellule staminali (SCF)	Sistemi di ricerca e sviluppo	455-MC
Stelo Pro	EZPassage	Codice 23181-010
Tumore T2	ATCC	T2 (174 x CEM. T2) (ATCC® CRL-1992™)
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo	Thermo Fisher Scientifico	Codice 25300-062
Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo	Thermo Fisher Scientifico	Codice 25200-072
U Piastra inferiore a 96 pozzetti	Corning, Inc.	Telefono 3799