Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione delle piastre di alimentazione delle cellule gliali (2 settimane prima del giorno della coltura)
- Sezionare la corteccia da un cervello di topo postnatale di 1 giorno e staccare le meningi.
- Tritare il tessuto della corteccia il più finemente possibile con le forbici pulite in una capsula di Petri pulita su una panca pulita.
- Trasferire il tessuto tagliato in 12 mL di HBSS e aggiungere 1,5 mL di tripsina al 2,5% e DNasi all'1% (wt/vol). Incubare a bagnomaria a 37 °C per 15 minuti, oscillando ogni 5 minuti. Il tessuto ben digerito diventa appiccicoso e forma un grande grappolo. Triturare 10-15 volte con una pipetta da 10 ml per scomporre il tessuto e ottenere una migliore digestione.
- Triturare il tessuto ben digerito 10-15 volte con una pipetta da 5 ml fino a quando la maggior parte dei pezzi scompare e il terreno diventa torbido. Passare attraverso un colino cellulare per rimuovere i pezzi rimanenti e aggiungere 15 ml di terreno gliale (terreno essenziale minimo (MEM) integrato con glucosio (0,6% wt/vol), siero di cavallo al 10% (vol/vol) e penicillina-streptomicina (1x) per fermare la digestione.
- Centrifugare le cellule a 120 x g per 5 minuti e aspirare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con terreno gliale fresco e seminare in piastre di coltura cellulare (circa 105 cellule/cm2 ).
- Sostituire il terreno con un terreno gliale fresco il giorno successivo per rimuovere le cellule non attaccate.
- Nutrire i piatti di glia ogni 3-4 giorni con un terreno di coltura fresco. Schiaffeggiare il pallone 5-10 volte con una mano per rimuovere le cellule attaccate in modo lasco prima di cambiare il terreno.
- Dopo 10 giorni di coltura, le cellule gliali dovrebbero essere quasi confluenti. Staccare le cellule gliali con tripsina-EDTA allo 0,25% e seminare circa10-5 cellule in una nuova piastra di coltura cellulare da 60 mm. Le celle rimanenti potrebbero essere congelate per un uso futuro.
- 3 giorni prima del giorno della coltura, cambiare il terreno gliale con il terreno di coltura neuronale (Neurobasal-A Medium con 1x GlutaMAX-I e 1x integratore di B27)
2. Cultura dei neuroni ippocampali
NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente.
- Sezionare 6-8 ippocampi da cuccioli postnatali di 1 giorno da topi ANK3-E22/23f/f con terreno HBSS in una capsula di Petri a temperatura ambiente. Tagliate gli ippocampi con le forbici da dissezione in pezzi più piccoli. Trasferire l'ippocampo dalla capsula di Petri in una provetta da 15 mL.
- Lavare l'ippocampo 2 volte con 5 ml di HBSS nella provetta. Lasciare l'ippocampo in 4,5 ml di 1x HBSS dopo il lavaggio.
- Aggiungere 0,5 mL di tripsina al 2,5% in 4,5 mL di HBSS e incubare a bagnomaria a 37 °C per 15 minuti. Capovolgere il tubo ogni 5 minuti. L'ippocampo ben digerito dovrebbe diventare appiccicoso e formare un grappolo. Se necessario, prolungare la digestione per altri 5 minuti.
- Lavare gli ippocampi con HBSS 3 volte per 5 minuti ciascuna. Non utilizzare un aspirapolvere per rimuovere l'HBSS. È molto facile rimuovere l'ippocampo.
- Aggiungere 2 ml di HBSS dopo il lavaggio e pipettare l'ippocampo su e giù con una pipetta Pasteur 15 volte.
- Triturare il fazzoletto con una pipetta Pasteur lucidata a fuoco (il diametro dell'apertura si restringe della metà) 10 volte. Non andare oltre le 10 volte anche se ci sono ancora pezzi rimanenti. L'overshearing uccide i neuroni.
- Far riposare il tubo per 5 minuti fino a quando tutti i pezzi non si saranno solidificati sul fondo. Utilizzare delicatamente un puntale di pipetta da 1 ml per trasferire il surnatante contenente i neuroni dissociati in piastre di placcatura (piastra da 105 cellule/60 mm). Aggiungerlo direttamente al mezzo di placcatura preincubato e agitare delicatamente la piastra.
- Ripeti i passaggi 2.6-2.7 con i blocchi rimanenti fino a quando la maggior parte dei blocchi non è scomparsa.
- 2-4 ore dopo la semina, controllare le piastre di placcatura con un microscopio ottico. La maggior parte dei neuroni dovrebbe essersi attaccata al vetrino coprioggetti. Le celle attaccate sono rotonde e luminose. Capovolgere i vetrini coprioggetti utilizzando una pinza a punta fine sui piatti di alimentazione delle cellule gliali con terreno di coltura neuronale precondizionato con il lato dei punti di cera rivolto verso il basso.
- I neuroni possono crescere nelle piastre di alimentazione delle cellule gliali per un massimo di 1 mese. Nutrire i neuroni ogni 7 giorni con 1 ml di terreno di coltura neuronale fresco.
- Passaggio facoltativo: 1 settimana dopo la semina, aggiungere citosina arabinoside (1-β-D-arabinofuranosilcitosina) a una concentrazione finale di 5 μM per frenare la proliferazione gliale.
