Generazione di una coltura di neuroni primari a bassa densità da neuroni embrionali congelati

Abstract

Fonte: Koganezawa, N. et al., Coltura primaria a bassa densità facile e riproducibile utilizzando stock congelato di neuroni ippocampali embrionali.J. Vis. Exp. (2023)

Questo video mostra il metodo di coltura di neuroni embrionali crioconservati, che prevede lo scongelamento controllato, la diluizione con un mezzo neurobasale e la semina su una piastra rivestita di poli-L-lisina. La successiva incubazione supporta la crescita e il mantenimento delle connessioni neuronali.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Rivestimento della piastra

1. Rivestire una micropiastra a 96 pozzetti con poli-L-lisina (1 mg/mL, diluita in tampone borato 0,1 M [pH: 8,5]; 100 μL/pozzetto) e incubare per una notte a 37 °C.
   nota: Rivestire solo i pozzetti che devono essere utilizzati. Negli esperimenti qui eseguiti, vengono utilizzati i 60 pozzi centrali. Il tampone borato viene preparato mescolando 50 mM di acido borico e 12 mM di borato in acqua sterilizzata.
2. Lavare la piastra due volte con acqua sterilizzata (250 μL/pozzetto).
3. Lavare la piastra una volta con terreno di coltura fresco senza supplementi (250 μL/pozzetto).
4. Asciugare la piastra su un banco pulito per 20 minuti.
5. Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio e mantenerla a 4 °C fino al momento dell'uso (valido per 1 mese).

2. Semina cellulare

1. Aggiungere 50 μL/pozzetto del terreno di coltura alla piastra rivestita e conservarla in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 30 minuti - 1 ora. Riempire i pozzetti periferici con acqua sterilizzata (200 μL/pozzetto).
   nota: Il terreno di coltura viene preparato aggiungendo 50 volte B-27, 400 volte Glutamax e 100 U/mL di penicillina/streptomicina al terreno neurobasale (fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli).
2. Rimuovere il crioviale neuronale dal serbatoio dell'azoto liquido. I neuroni utilizzati qui erano neuroni crioconservati con dimetilsolfossido (DMSO-crioconservati).
3. Immergere il crioviale in un blocco termico a 37 °C per un massimo di 3 minuti e scongelare parzialmente il contenuto. Non riscaldare il crioviale troppo a lungo. Trasferire il contenuto in una provetta da 50 ml non appena viene scongelata.
4. Trasferire lentamente il contenuto crioviale dei neuroni in una provetta sterile da 50 mL (50 μL/s) utilizzando una pipetta da 1 mL con punta a pori larghi.
5. Sciacquare il crioviale vuoto con 1 mL di terreno di coltura (temperatura ambiente; RT). Trasferire 1 mL di terreno di coltura dalla criovale goccia a goccia (50 μL/s) alla provetta da 50 mL contenente la sospensione cellulare.
6. Aggiungere 9 mL del terreno di coltura (RT) alla provetta da 50 mL per goccia (0,5 mL/s) e portare il volume a 11 mL. Non ripetere il pipettaggio, ma mescolare lentamente la sospensione cellulare.
7. Contare il numero di cellule (utilizzare un contacellule o un emocitometro).
8. Trasferire tutta la sospensione cellulare in un serbatoio ed erogare la sospensione cellulare nella piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale con puntali a pori larghi (1,0 x 10⁴ cellule/pozzetto). Per ridurre l'evaporazione del terreno di coltura, riempire i pozzetti periferici con acqua sterilizzata (passaggio 2.1).
   nota: Questo studio conferma che l'evaporazione del terreno di coltura è piccola per una coltura di 3 settimane senza scambio di terreno. Il tasso di riduzione del mezzo è del 3,6% (n = 120 pozzi). Pertanto, il cambiamento di osmolalità non sarà drastico durante il periodo di incubazione di 3 settimane.
9. Incubare i neuroni per 1-2 ore in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂.
10. Sostituire il terreno di coltura con 100 μl di terreno di coltura preriscaldato (37 °C) per pozzetto e rimetterlo in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ (non è necessario cambiare il terreno durante la coltura).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 96 pozzetti	Società Zeon		dotato
Piastra a 96 pozzetti	Greiner	655986
B-27	Gibco	Codice 17504-044	2 v/v% per le piastre MEA; 50x per le piastre normali
borace	sigma	B-9876	Concentrazione finale 12 mM
acido borico	WAKO	Codice 021-02195	Concentrazione finale 50 mM
Albumina sierica bovina	Millipore	12659-100G	Concentrazione finale: 3% in PBS
GlutaMAX	Gibco	Codice 35050-061	2,5 mM per le lastre MEA; 400x per le lastre normali
Analizzatore in cella 2200	Citiva		Immagini a fluorescenza
Neurobasale	Gibco	Codice 21103-049
Penicillina/Streptomicina	Gibco	Codice: 15140-122	100 U/mL per piastre normali
Penicillina/Streptomicina	nacalai tesque	Codice 26253-84	100 μg/mL per piastre MEA
Poli-L-lisina	sigma	P2636	Diluito nel tampone borato (concentrazione finale: 1 mg/mL)
Neurone del cielo	AlzMed , Inc.	ARH001	1,0 x 106 cellule/provetta