Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Rivestimento dei vetrini coprioggetti con poli-L-lisina
- Preparare i vetrini coprioggetti scongelando un'aliquota da 5 mL di soluzione di poli-L-lisina (PLL) da 200 μg/mL. Diluire questa soluzione madre a 20 μg/mL aggiungendo 45 mL di acqua pura per iniezione. Sterilizzare la soluzione con filtro in una nuova provetta conica da 50 mL. Etichettare questo tubo come "PLL Sterile".
nota: Utilizzare acqua conservata a temperatura ambiente per accelerare il processo di sbrinamento.
- Aggiungere 100 vetrini coprioggetti sterili, rotondi, da 12 mm alla soluzione sterile di PLL. Agitare il tubo ogni 5-10 minuti, per 2-3 minuti, per garantire un rivestimento uniforme. Rivestire i vetrini coprioggetti in questo modo per 1 h.
nota: I vetrini coprioggetti rotondi in vetro di fabbricazione tedesca (diametro = 12 mm) sono preferibili, in quanto forniscono una superficie di coltura affidabile e si inseriscono facilmente nei pozzetti di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti.
- Dopo 40 minuti di rivestimento PLL, prendere 2 pezzi di carta velina e adagiarli nella cabina di flusso. Sterilizzare la carta con etanolo al 70%, quindi appiattirla per rimuovere le pieghe e lasciare asciugare.
- Dopo aver rivestito i vetrini coprioggetti per 1 ora con PLL, rimuovere la soluzione PLL in eccesso e aggiungere acqua sterile per iniezione. Agitare delicatamente i vetrini coprioggetti per 2-3 s per consentire la rimozione del PLL in eccesso. Ripetere questa fase di risciacquo altre 2 volte.
- Rimuovere l'acqua in eccesso, quindi trasferire i vetrini coprioggetti sulla carta velina sterile. Separare accuratamente ogni vetrino coprioggetti utilizzando una pinza curva e lasciare asciugare.
nota: I vetrini coprioggetti che non si separano facilmente possono essere scartati. In alternativa, è possibile aggiungere una piccola quantità di acqua per facilitare la separazione.
- Una volta asciutti, trasferire i vetrini coprioggetti in una piastra di coltura a 24 pozzetti.
nota: I vetrini coprioggetti devono essere preparati circa 30 minuti-1 ora prima di iniziare il processo di dissezione. Le piastre possono essere conservate in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2 fino al momento del bisogno.
2. Dissociazione del tessuto ippocampale e corticale
- Preparazione di soluzioni per colture cellulari
- Per la dissociazione del tessuto neurale, scongelare prima un'aliquota di 40 mL di tampone per colture cellulari (composizione [in mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 NaH2PO4, 1 MgSO4·7H2O, 1 CaCl2·2H2O, 0,5 EDTA·2Na·2H2O e 25 D-glucosio, pH = 7,4). Misurare 12 mL di tampone per colture cellulari in una provetta conica da 15 mL; etichetta come "BSA". Misurare 5 mL di tampone per colture cellulari in una provetta da 15 mL diversa; etichetta come "papaina". Incubare entrambe le provette a bagnomaria per 15 minuti a 37 °C.
- Filtrare-sterilizzare il tampone di coltura cellulare rimanente, etichettare come "Tampone - Sterile" e conservare a 4 °C fino al momento del bisogno.
- Pesare 120 mg di albumina sierica bovina (BSA) e aggiungerla alla provetta etichettata con "BSA". Pesare 7 mg di papaina e aggiungerli al tubo etichettato con la dicitura "papaina". Rimettere entrambi i tubi nel bagnomaria per 15 min.
nota: È utile aggiungere una piccola quantità di tampone alla pesa per facilitare il trasferimento della polvere di papaina.
- Una volta che tutte le polveri si sono disciolte, sterilizzare con filtro ogni soluzione in una provetta conica fresca da 15 mL. Per la papaina in tubo, etichettare la soluzione filtrata come "papaina - Sterile". Per la provetta BSA, dividere la soluzione sterile di BSA in 3 provette, ciascuna contenente 4 mL di soluzione BSA. Etichettare ogni provetta come "BSA - Sterile" e "1", "2" o "3". Rimettere tutte le provette nel bagnomaria e continuare a incubare a 37 °C fino al momento del bisogno.
- Preparazione per la dissezione tissutale
- Prendere un singolo pezzo di carta da filtro da 35 mm (vedi Tabella dei materiali) e sterilizzare con etanolo al 70%; lasciare asciugare nel coperchio di una capsula di Petri da 100 mm, in una cappa a flusso. Disporre le forbici, le pinze, il bisturi e la spatola (vedi Tabella dei materiali) necessari per la dissezione dell'ippocampo e della corteccia.
- Posizionare due piastre di Petri da 35 mm e una piastra di Petri da 100 mm contenenti carta da filtro sterile in una posizione accessibile al centro della camera di flusso.
- Raccogliere NexCre transgenico; Cuccioli di topo Ai9 e VGAT Venus che devono essere sezionati. Utilizzare una lampada fluorescente con filtri di eccitazione ed emissione appropriati (vedi Tabella dei materiali) per distinguere i cuccioli fluorescenti dai compagni di cucciolata di tipo selvatico.
- Immediatamente prima di sezionare gli animali, riempire ogni capsula di Petri da 35 mm con un tampone per colture cellulari sterile e refrigerato.
nota: Una capsula di Petri serve per pulire gli strumenti tra una dissezione e l'altra e l'altra per raccogliere l'ippocampo e la corteccia.
- Dissezione tissutale
- Non appena il tampone di coltura cellulare viene versato, decapitare un topo o un cucciolo di ratto transgenico postnatale 0-2 giorni utilizzando forbici grandi e affilate e utilizzare una capsula di Petri sterile da 100 mm per trasferire la testa nella cappa di flusso. Usa pinze, forbici e una spatola per trasferire con cura il cervello di un cucciolo transgenico su carta da filtro sterile.
- Usa un bisturi di tipo 22 per sezionare il cervelletto e separare i 2 emisferi. Usa una piccola spatola per arrotolare lateralmente gli emisferi. Su ogni emisfero, premere delicatamente in modo che la corteccia entri in contatto con la carta da filtro. Muovi delicatamente le regioni del mesencefalo per rivelare l'ippocampo e la corteccia.
nota: Fare attenzione a non applicare troppa pressione quando si preme sugli emisferi o le cellule possono schiacciarsi.
- Usa un bisturi o una spatola per separare l'ippocampo e la corteccia da ciascun emisfero. Trasferire il tessuto sezionato in una piastra di Petri da 35 mm contenente tampone di coltura cellulare refrigerata.
nota: Se si sezionano più animali, conservare il tampone sterile per colture cellulari in una provetta conica da 50 mL su ghiaccio. Dopo ogni dissezione, trasferire il tessuto sezionato nel tampone di coltura cellulare refrigerato.
- Dopo aver sezionato con successo il tessuto cortico-ippocampale, trasferire la soluzione sterile di papaina dal bagnomaria alla cappa di flusso. Utilizzare una pipetta Pasteur da 3 ml per trasferire l'ippocampo e la corteccia sezionati sul coperchio di una piastra di Petri sterile da 35 mm. Tagliare con movimenti incrociati, utilizzando la parte piatta di un bisturi di tipo 22, fino a quando il tessuto non è in piccoli pezzi.
- Utilizzare una piccola quantità di soluzione di papaina per trasferire il tessuto tritato dal coperchio della capsula di Petri alla provetta sterile di papaina. Rimettere la provetta di papaina nel bagnomaria e incubare il fazzoletto a 37 °C per 25 minuti.
- Durante l'incubazione della papaina, preparare una soluzione completa di terreno di fluorescenza. Scongelare un'aliquota da 1 ml di B27, un'aliquota da 0,5 ml di Glutamax e un'aliquota da 0,5 ml di Pen-Strep. Aliquotare 48,5 mL di terreno a bassa fluorescenza in una provetta conica da 50 mL. Aggiungere B27, Glutamax e Pen-Strep alla soluzione. Agitare bene la soluzione, quindi sterilizzare con filtro ed etichettare come "Hibernate A complete media" (con data e iniziali). Incubare a 37 °C a bagnomaria.
- Dopo l'incubazione della papaina, trasferire la provetta di papaina e le provette sterili BSA nella camera di flusso. Utilizzare una pipetta Pasteur da 1 ml per rimuovere solo il tessuto cortico-ippocampale dalla provetta di papaina nella provetta BSA da 1,
nota: Fare attenzione a ridurre al minimo il trasferimento della soluzione di papaina in eccesso.
- Dissociazione delle cellule
- Per rompere eventuali grumi di tessuto di grandi dimensioni, triturare il tessuto più volte utilizzando una pipetta Pasteur da 1 mL. Successivamente, triturare il tessuto 7 volte utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine. Lasciare riposare il tessuto per 30 s, consentendo ai pezzi di tessuto più grandi di sedimentare.
- Dopo 30 s, trasferire 1 mL inferiore di soluzione e tessuto dalla provetta BSA 1 alla provetta BSA 2. Triturare il tessuto nella provetta BSA 2 più volte utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine.
- Dopo la triturazione, trasferire nuovamente 1 mL inferiore di tessuto e soluzione dalla provetta BSA 1, ma ora alla provetta BSA 3. Triturare il tessuto nella provetta BSA 3 più volte utilizzando una pipetta Pasteur a punta fine.
- Dopo la triturazione, trasferire tutta la soluzione e il tessuto dalle provette 2 e 3 nella provetta BSA 1. Triturare altre 2-3 volte e centrifugare a 3.000 x g per 3 min.
- Durante la centrifugazione, preparare il terreno basale A neurale completo (NBA media). Aliquotare 48,5 mL di terreno NBA in una provetta conica da 50 mL e incubare a 37 °C in un bagno d'acqua. Etichetta questo tubo "solo NBA". Inoltre, scongelare un'aliquota da 1 ml di B27, un'aliquota da 0,5 ml di Glutamax e un'aliquota da 0,5 ml di Pen-Strep a temperatura ambiente.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere con cura il surnatante dal tessuto pellettato e risospendere le cellule in 2 mL di terreno completo. Utilizzare una pipetta P1000 per triturare il tessuto su e giù 20 volte.
nota: Fare attenzione a non pipettare le cellule troppo energicamente. Se viene applicata troppa pressione, le celle possono danneggiarsi.
- Utilizzare una pipetta Pasteur da 1 ml per filtrare la sospensione cellulare attraverso un setaccio cellulare da 30 μm in una provetta per campioni di polistirene.
nota: Se la sospensione cellulare non passa immediatamente attraverso il setaccio cellulare, potrebbe essere necessario premere sulla parte superiore del setaccio con un guanto sterile per avviare il flusso. Questo importante passaggio impedisce l'intasamento del selezionatore cellulare.
- Per la raccolta dei neuroni dopo lo smistamento, preparare le provette di raccolta pipettando 300 μl di terreno completo fino al numero richiesto di provette in polipropilene.
- La sospensione cellulare è ora pronta per essere portata al selezionatore di cellule per lo smistamento. Prelevare la sospensione cellulare, le provette di raccolta aggiuntive e il terreno di ricambio completo nel caso in cui sia necessaria la diluizione del campione.
3. Selezione cellulare di neuroni GABAergici o glutammatergici purificati
NOTA: Per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione batterica durante la selezione, sciacquare il tubo del campione della selezionatrice con etanolo al 70% per almeno 5 minuti prima della cernita. I parametri di selezione dettagliati variano da uno strumento all'altro, le considerazioni fondamentali sono le seguenti.
- Durante il primo ordinamento cellulare, stabilire i livelli di fluorescenza di fondo da cellule non marcate ordinando e confrontando le cellule di un animale di tipo selvatico.
- Per ogni tipo di cella fluorescente da ordinare, scegliere i filtri di eccitazione ed emissione appropriati. Eccitare le proteine di Venere e TdTomato utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione rispettivamente di 488 nm o 531 nm. Rileva la luce emessa attraverso i set di filtri di emissione 530/40 e 575/30, rispettivamente.
- Aggiungere provette di raccolta in polipropilene, contenenti 300 μl di terreno completo, al selezionatore di cellule per la raccolta di cellule.
- Per un'elevata purezza, selezionare le celle fluorescenti marcate in modo brillante (vedere la Figura 1B per esempio i grafici a punti delle celle selezionate).
- Dopo la cernita, per ottenere risultati ottimali, eseguire un test di purezza delle cellule selezionate per stimare i livelli di purezza. Si noti che il tasso di recupero tipico delle cellule dopo lo smistamento è compreso tra il 70 e l'80%.
- Annotare il numero di cellule ordinate in ciascuna provetta di raccolta. Questo valore è dato dallo strumento di smistamento delle celle.
nota: La selezione delle celle può essere eseguita utilizzando un ugello da 70 μm (70 psi di pressione del fluido della guaina) o un ugello da 100 μm (20 psi di pressione del fluido della guaina).
4. Coltura di Neuroni Ordinati
- Dopo la selezione delle cellule, trasferire le cellule raccolte in provette da centrifuga a fondo tondo da 2 mL, utilizzando una pipetta Pasteur da 1 mL. Centrifugare le celle a 3.000 x g per 3 minuti per formare un pellet di cellule.
nota: Per aiutare a identificare la posizione del pellet della cella, orientare le provette da centrifuga a fondo tondo con la cerniera del coperchio rivolta verso l'esterno, in modo da consentire la formazione del pellet della cella sul retro della provetta da centrifuga (cioè sullo stesso lato della provetta della cerniera).
- Durante la centrifugazione, aggiungere 1 mL di B27, 0,5 mL di Glutamax e 0,5 mL di Pen-Strep ai 48,5 mL di terreno NBA preriscaldato. Agitare bene la soluzione, quindi filtrare sterilizzare ed etichettare come "NBA complete media" (con data e iniziali). Rimettere a bagnomaria fino al momento del bisogno.
- Dopo la centrifugazione, utilizzare una pipetta Pasteur da 1 ml per trasferire il surnatante in un'altra provetta da centrifuga (conservare il surnatante nel caso in cui il pellet cellulare sia stato disturbato). Risospendere il pellet cellulare nella quantità richiesta di terreno NBA completo preriscaldato per ottenere una densità cellulare di 1.000 cellule/μL. Risospendere le cellule pipettando su e giù con una pipetta P200 o P1000.
- Per confermare la presenza di cellule dissociate, controllare la soluzione cellulare al microscopio, utilizzando una lente obiettivo 4x o 10x. In alternativa, pipettare una piccola quantità di soluzione cellulare su un vetrino coprioggetti e controllare al microscopio. Se è presente un numero elevato di cellule, il surnatante del passaggio 4.3 può essere scartato.
- Prima di placcare le celle, agitare a velocità media per 2-3 s per garantire una sospensione uniforme delle celle. Dopo il vortex, pipettare rapidamente 10 μl della sospensione cellulare al centro di ciascun vetrino coprioggetti. Dopo aver pipettato le cellule, rimettere rapidamente ciascuna piastra nell'incubatore (5% CO2/37 °C) e incubare per 1 h.
nota: Se si aggiungono celle a più piastre da 24 pozzetti, garantire una densità uniforme delle celle facendo vorticare le celle tra le piastre.
- Dopo 1 ora, alimentare le cellule con 500 μL di terreno NBA completo preriscaldato e rimetterle nell'incubatore.
nota: Quando si alimentano le cellule, è importante pipettare delicatamente il terreno lungo il lato del pozzetto per evitare il distacco delle cellule. Per esperimenti brevi (<16 giorni), l'alimentazione alla densità sopra indicata non è necessaria. Quando si piastra una maggiore densità di cellule, possono essere necessari intervalli di alimentazione più frequenti.
