1. Preparazione dei Media
NOTA: Il protocollo si basa sull'utilizzo di un mix di due mezzi separati: DMEM/F12 integrato con integratore di N2 modificato e Neurobasal integrato con integratore di B27, tipicamente in un rapporto 1:1.
- Preparare l'integratore di N2 modificato mescolando i componenti in un tubo da 15 ml. Non vorticare o filtrare; Mescolare capovolgendo il tubo fino a quando la soluzione non è limpida.
- Iniziare pipettando 7,2 ml di DMEM/F12, quindi aggiungere 1 ml di insulina 25 mg/ml (composta da 0,01 M HCl) e mescolare bene capovolgendo la provetta. Ci vogliono un paio di minuti prima che la soluzione sia limpida.
- Aggiungere 1 ml di 100 mg/ml di apo-transferrina (preparata in acqua), 33 μl di progesternone 0,6 mg/ml (composto in etanolo), 100 μl di 160 mg/ml (1 M) di putrescina (preparata in acqua), 10 μl di selenito di sodio 3 mM (preparata in acqua) e 666 μl di albumina sierica bovina al 7,5% e mescolare bene la provetta. Aliquotare in 2,5 ml e conservare a -20 °C per un massimo di 2 mesi.
- Prepara il supporto.
- A 250 ml di DMEM/F12 aggiungere 2,5 ml di N2. Mescolare bene ma non agitare o filtrare.
- A 250 ml di terreno neurobasale, aggiungere 5 ml di integratore di B27. Mescolare bene ma non agitare o filtrare.
- Mescola i file multimediali dei passaggi 1.2.1 e 1.2.2 in un rapporto 1:1. In alcuni casi può essere necessaria una miscela 1:3 (integrata come miscela 1:1 al punto 1.2.4).
- Alla miscela aggiungere 0,5 ml di L-glutammina (concentrazione finale 0,2 mM) e 3,5 μl di 2-mercaptoetanolo (concentrazione finale 0,1 mM) e mescolare bene senza agitare. Conservare il supporto a 4 °C per un massimo di 3 settimane ed evitare l'esposizione alla luce. Questo mix finale è chiamato N2B27.
- Preparare la soluzione di gelatina.
- Preparare una soluzione di gelatina all'1% in acqua ultrapura e sterilizzare in autoclave a 121 °C, 15 psi, per 15 min. È importante che la bottiglia utilizzata per questo sia completamente pulita da detergenti o disinfettanti, quindi si consiglia di utilizzare una nuova bottiglia per questo e di sciacquarla sempre e solo in acqua ultrapura tra un utilizzo e l'altro. Aliquotare la soluzione all'1% in aliquote da 50 ml e conservare a 4 °C per mesi.
- Scaldare un'aliquota di gelatina all'1% a bagnomaria a 37 °C fino a quando non si scioglie e aggiungere a 500 ml di soluzione salina tiepida tamponata con fosfato (PBS). Mescolare bene e pipettare abbastanza da coprire il fondo di ogni pozzetto o piastra. Lasciare che la gelatina ricopra la superficie per almeno 30 minuti.
2. Placcare le Celle
NOTA: Questo protocollo si applica ugualmente alle ESC di topo coltivate in siero al 10% con fattore inibitorio della leucemia (LIF), alla sostituzione del siero con LIF o ai terreni privi di siero con LIF e proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4) o agli inibitori MEK e GSK3 (2i media) con o senza LIF. Tuttavia, i tempi e l'efficienza della differenziazione possono variare a seconda dei terreni e delle cellule. Per gli esperimenti qui mostrati abbiamo utilizzato la linea ESC di topo 46C (con un reporter EGFP inserito in uno degli alleli endogeni di Sox1), coltivata in GMEM con il 10% di siero e LIF. Per ottenere risultati ottimali, è importante che le cellule siano dissociate e ripiastrate nel terreno N2B27; il semplice cambio dei terreni da GMEM/siero/LIF a N2B27 comporta sempre una ridotta efficienza di differenziazione rispetto alla riplaccatura delle cellule.
- Coltiva le cellule in GMEM con il 10% di siero, 1 mM di piruvato di sodio, 1 di aminoacidi non essenziali, 0,1 M di 2-mercaptoetanolo e 100 unità/ml di LIF13. Per ottenere una coltura subconfluente di ESC di topo, piastrate 1 x 106 cellule in un pallone di coltura T25 che richiederà 2 - 3 giorni.
- Osservare le cellule al microscopio a campo chiaro. Quando le cellule sono subconfluenti e pronte per il passaggio, sciacquarle due volte in PBS. Aggiungere 1 ml di reagente di dissociazione cellulare e rimettere nell'incubatore per 2 - 5 minuti. Sebbene la tripsina e altri enzimi possano essere utilizzati anche per la dissociazione cellulare, possono avere un impatto negativo sull'adesione cellulare, quindi le densità di placcatura dovranno essere regolate.
- Una volta che le cellule iniziano a sollevarsi dalla piastra, picchiettare il recipiente per rimuoverle in una sospensione a cellula singola. Raccogliere le cellule in 10 ml di terreno e reagente di dissociazione cellulare e pipettare in una provetta da centrifuga da 15 ml.
- Centrifugare le celle a 300 x g per 3 minuti a RT.
- Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di N2B27 preriscaldato pipettando su e giù 3 - 5 volte. Quando si pipetta la sospensione verso il basso, pipetare contro il lato del tubo per evitare la formazione di bolle. Contare le cellule con un contatore di cellule automatizzato o un emocitometro e registrare la concentrazione.
- Preparare una sospensione cellulare contenente il numero desiderato di cellule per unità di volume da placcare per pozzetto in N2B27 preriscaldato. Una densità di 10.500 cellule per cm2 in una piastra a 6 pozzetti (cioè 1 x 105 celle per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) è ottimale. Vedere la Tabella 1 per il numero suggerito di cellule per cm2 e i volumi dei terreni di placcatura per vari recipienti di coltura cellulare.
- Aspirare la gelatina dal recipiente di coltura e impiattare la sospensione cellulare in base alla densità e al volume suggeriti nella Tabella 1. Non agitare le piastre, poiché ciò concentrerà le cellule al centro. Porre le colture in un'incubatrice umida a 37 °C, 5% CO2.
- Cambiare i supporti ogni 1 - 2 giorni sostituendo tutti i supporti con N2B27 nuovo. Pipettare delicatamente poiché il lavaggio delle cellule potrebbe influire sulla densità e ridurre l'efficienza di differenziazione nei giorni successivi. Se la vitalità iniziale dopo la piastratura è scarsa, piastrate le cellule in una miscela 1:3 di terreni integrati con N2 e B27 e cambiatela in N2B27 dopo i primi due giorni. Le cellule inizieranno a differenziarsi e dovrebbero mostrare l'espressione di Sox1 (visibile dalla fluorescenza verde del reporter nella linea cellulare 46C qui utilizzata) entro 4-6 giorni.
Tabella 1. Densità di placcatura e volumi di media suggeriti per recipienti di diverse dimensioni. Le densità di placcatura in questa tabella sono state determinate utilizzando la linea cellulare 46C. Per ottenere risultati ottimali, potrebbe essere necessario regolare la densità di placcatura di ogni singola linea.
| piattaforma | Intervallo di densità efficace (celle/cm2) | Intervallo dal numero di cella alla piastra | Volume iniziale suggerito del terreno (μl) | Volume del terreno suggerito dopo il giorno 1 (μl) |
| Piastra a 6 pozzetti | 10.500 - 36.500 | 99.750 - 346.750 | 1.000 | 2.000 |
| Piastra a 24 pozzetti | 15.600 - 46.800 | 29.640 - 88.920 | 500 | 1.000 |
| piastra a 96 pozzetti | 103.500 - 260.000 | 33.120 - 83.200 | 100 | 200 |