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1. Differenziazione HNSC sulla cultura tridimensionale (3D)
NOTA: Isolare e derivare cellule staminali neurali umane (hNSC) da un tessuto eticamente approvato descritto in una precedente pubblicazione. Si prega di seguire le linee guida etiche e istituzionali nel seguire questa procedura.
- Coltura 3D con piastra a 12 pozzetti
- Utilizzare una tecnica asettica durante tutta la procedura. In una cappa di sicurezza biologica, reidratare gli scaffold aggiungendo 2 ml/pozzetto di etanolo al 70% preparato utilizzando acqua per l'irrigazione (WFIr). Evitare di toccare le impalcature erogando il 70% di etanolo lungo la parete di ciascun pozzetto.
- Aspirare accuratamente l'etanolo al 70% e lavare immediatamente gli scaffold con 2 ml/pozzetto di Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM: F12) per 1 minuto. Ripetere la procedura di lavaggio due volte. Aspirare con cura il DMEM: F12 dopo il lavaggio finale.
- Rivestire gli scaffold aggiungendo 2 ml/pozzetto di laminina (10 μg/ml) in DMEM: F12. Incubare la piastra a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per un minimo di 2 ore. Lavare la piastra con DMEM caldo: F12.
- Seminare ogni impalcatura con circa 500.000 hNSC in un volume di 150 μl di fattori di crescita (GF) RMM+.
- Incubare la piastra per 3 ore a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per consentire alle cellule di depositarsi negli scaffold.
- Aggiungere 3,5 ml di RMM a ciascun pozzetto, facendo attenzione a non rimuovere le cellule dagli scaffold.
- Incubare la piastra per 7 giorni; sostituire il terreno RMM (3,5 ml/pozzetto) dopo 1 giorno (prima poppata) e di nuovo dopo 2-3 giorni dalla prima poppata.