Generazione di neuroni simpatici postgangliari da cellule staminali pluripotenti umane

Abstract

Fonte: Wu, H. F., et al. Differenziazione efficiente dei neuroni simpatici postgangliari utilizzando cellule staminali pluripotenti umane in condizioni di coltura prive di alimentatore e chimicamente definite. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video mostra un metodo in vitro per generare neuroni simpatici postgangliari da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC). Le hPSC sono differenziate in cellule della cresta neurale (NCC) su un supporto della matrice della membrana basale utilizzando un mezzo di differenziazione. Gli NCC vengono quindi dissociati e formati in sferoidi utilizzando un altro mezzo di differenziazione. Infine, gli sferoidi vengono trasformati in neuroni simpatici postgangliari utilizzando un mezzo neuronale simpatico.

Protocollo

1. Configurazione per il rivestimento delle stoviglie, la preparazione dei terreni e la manutenzione dell'hPSC

1. Rivestimento dei piatti
   1. Rivestimento di vitronectina (VTN)
      1. Porre i flaconcini di VTN a bagnomaria a 37 °C fino a completo scongelamento, quindi mescolare accuratamente.
      2. Per una piastra di Petri da 100 mm, mescolare 7 mL di soluzione salina tamponata con fosfato 1x (PBS) con 0,5 mg/mL di VTN, aggiungere la soluzione VTN alla piastra e incubare a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.
   2. Rivestimento a matrice di membrana seminterrato
      1. Scongelare le fiale della matrice della membrana basale (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio a 4 °C per una notte.
      2. Per un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, mescolare 2 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) con 20 μL di matrice a membrana basale 100x, aggiungere la soluzione della matrice a membrana basale al piatto, avvolgere il piatto con pellicola di paraffina e conservare in un contenitore pulito a 4 °C per una notte. Lavora il più rapidamente possibile. Le stoviglie rivestite possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
   3. Rivestimento in poliornitina (PO)/laminina (LM)/fibronectina (FN)
      1. Il primo giorno, per un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti, miscelare 15 μg/mL di PO con 1 mL di 1x PBS, incubare a 37 °C, 5% di CO₂ per una notte. Scongelare sia LM che FN a -20 °C per una notte e conservare a 4 °C fino a completo scongelamento.
      2. Il secondo giorno, aspirare la soluzione di PO, lavare i pozzetti 2 volte con 1 PBS, aggiungere 1 mL di 1x PBS contenente 2 μg/mL di LM e 2 μg/mL di FN e incubare a 37 °C in CO₂ al 5% per una notte. A questo punto la piastra con la soluzione LM/FN può essere conservata nell'incubatrice per mesi purché non si asciughi. Aggiungi più 1x PBS per evitare che il piatto si secchi.
2. Preparazione dei terreni
   1. Preparare il terreno Essential 8 (E8) scongelando un flacone di integratore di E8 a 4 °C durante la notte. Mescolare l'integratore con 500 ml di terreno E8 e antibiotici se necessario.
      nota: La soluzione E8 funzionante dovrebbe essere esaurita entro 2 settimane.
   2. Preparare il terreno di congelamento hPSC mescolando 90 mL di terreno E8 completo con 10 mL di dimetilsolfossido (DMSO) per un volume totale di 100 mL. Filtro sterilizzare.
   3. Preparare il terreno di differenziazione dal giorno 0 al giorno 1 mescolando 100 mL di terreno essenziale 6 (E6) con 10 μM di SB431542, 1 ng/mL di proteina morfogenetica ossea 4 (BMP4), 300 nM di CHIR99021 e 10 μM Y27632 per un volume totale di 100 mL.
   4. Preparare il terreno di differenziazione dal giorno 2 al giorno 10 mescolando 100 mL di terreno E6 con 10 μM SB e 0,75 μM CHIR99021 per un volume totale di 100 mL.
   5. Preparare il terreno sferoidale dal giorno 10 al giorno 14 mescolando il terreno neurobasale con 2 mL di B27 (50x), 1 mL di N2 (100x), 2 mM di L-glutammato, 3 μM di CHIR99021 e 10 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF2) per un volume totale di 100 mL.
   6. Preparare il terreno dal giorno 14 al giorno 28 per il mantenimento a lungo termine degli sferoidi aggiungendo 0,5 μM di acido retinoico fresco (RA) al terreno sferoidale dal giorno 10 al giorno 14 per ogni poppata.
      nota: Mantenere sempre l'AR a -80 °C.
   7. Preparare il terreno di maturazione SymN mescolando il terreno neurobasale con 2 mL di B27 (50x), 1 mL di N2 (100x), 2 mM di L-glutammato, 25 ng/mL di fattore neurotrofico derivato da linee cellulari gliali (GDNF), 25 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), 25 ng/mL di fattore di crescita nervoso (NGF), 200 μM di acido ascorbico e 0,2 mM di dibutirriladenosina monofosfato ciclico (dbcAMP) per un volume totale di 100 mL. La soluzione deve essere utilizzata entro 2 settimane. Prima di ogni poppata, aggiungere 0,125 μM di AR fresco. Questa soluzione viene utilizzata dal giorno 14 (opzione 1) o dal giorno 28 (opzione 2).
   8. Preparare il tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) mescolando DMEM con FBS al 2%, 2 mM di L-glutammato e antibiotici, se necessario, per un volume totale di 100 mL.
3. Manutenzione hPSC
   1. Scongelamento e mantenimento delle hPSC
      1. Preparare una pirofila da 100 mm rivestita in VTN.
      2. Per scongelare un flaconcino di hPSC direttamente dall'azoto liquido, mettere il flaconcino in un bagno d'acqua a 37 °C, facendo oscillare con cautela il tubo nell'acqua fino a quando non si scongela. Trasferire le hPSC scongelate in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di 1x PBS e centrifugare a 200 x g per 4 minuti.
      3. Eliminare il surnatante e aggiungere 1 mL di terreno E8 alla provetta. Pipettare alcune volte per risospendere completamente il pellet e quindi aggiungere altri 9 mL di terreno E8 per raggiungere i 10 mL totali.
      4. Aspirare la soluzione VTN dal piatto da 100 mm.
      5. Trasferire le hPSC in una piastra da 100 mm, agitare delicatamente (su-giù e sinistra-destra, non in cerchio) per assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente nella piastra
      6. Incubare a 37 °C, in CO₂ al 5%.
      7. Il giorno seguente, aspirare tutto il terreno e somministrare con 10 ml di E8.
      8. Nutri in questo modo ogni giorno per i prossimi 3-4 giorni e poi preparati a dividere.
   2. Suddivisione di hPSCs
      NOTA: le hPSC nel punto di scissione dovrebbero essere confluenti all'80%-90%. Dovrebbero essere osservate grandi colonie con bordi lisci e luminosi. Tuttavia, il contatto tra ciascuna colonia dovrebbe essere evitato (Figura 1B, giorno 0 e Figura 4B).
      1. Preparare piatti da 100 mm rivestiti in VTN secondo necessità.
      2. Aspirare l'E8 e lavare il piatto che deve essere diviso 1x con 1x PBS.
      3. Aspirare 1x PBS e aggiungere 4 mL di EDTA 0,25 M. Incubare per 2 minuti a 37 °C, 5% CO₂,
         nota: Le hPSC dovrebbero essere divise/riclassificate come piccole colonie. Non trattare con acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per più di 2 minuti per prevenire la separazione in singole cellule. Le cellule devono essere ancora attaccate alla superficie della piastra dopo il trattamento di 2 minuti.
      4. Aspirare l'EDTA, staccare le colonie pipettando con forza 10 mL di terreno E8 sulla superficie della piastra e raccogliere tutto il terreno e le cellule in una provetta da 15 mL.
      5. Con le hPSC all'80%-90% di confluenza, dividere le colonie da 1:15-1:20. Ad esempio, per dividere le hPSC di 1:20 in un piatto da 100 mm, prendere 500 μL di soluzione E8/hPSCs e mescolarle con 9,5 mL di terreno E8 fresco.
      6. Piastra hPSC in piastre da 100 mm rivestite in VTN.
         nota: Si consiglia di stabilire il rapporto di divisione ideale per ciascun ricercatore e linea cellulare in modo indipendente.
   3. Congelamento di hPSC
      1. Per una capsula da 100 mm di hPSC pronta per essere divisa, preparare tre crioviali e 3,5 ml di terreno di congelamento.
         NOTA: I terreni e le fiale devono essere conservati a 4 °C o in ghiaccio fino al momento dell'uso.
      2. Aspirare E8 e lavare il piatto 2 volte con 1 PBS.
      3. Aspirare 1x PBS e aggiungere 4 mL di EDTA 0,25 M, incubare per 2 minuti a 37 °C, in CO₂,
         NOTA: le hPSC dovrebbero essere congelate come piccole colonie nel momento in cui verrebbero divise. Non trattare le cellule con EDTA per più di 2 minuti per evitare la separazione in singole cellule. Le cellule devono essere ancora attaccate alla superficie del piatto dopo il trattamento di 2 minuti.
      4. Aspirare l'EDTA, staccare le colonie pipettando con forza 10 mL di 1x PBS sulla superficie della piastra e raccogliere tutto il terreno e le cellule in una provetta da 50 mL.
      5. Aggiungere 20 ml di 1x PBS e centrifugare a 200 x g per 4 minuti per lavare via l'EDTA rimanente.
      6. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 3 mL di mezzo di congelamento.
      7. Distribuire uniformemente le hPSC nei tre crioviali, 1 ml ciascuno.
      8. Conservare a -80 °C per una notte in una scatola di congelamento controllato o in un panino di polistirolo per garantire un lento calo della temperatura, quindi trasferire in un serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.

2. Seeding di hPSC per iniziare la differenziazione (giorno 0)

NOTA: le hPSC dovrebbero essere pronte per la differenziazione dopo essere state stabilizzate (cioè, essere divise 2-3 volte dopo lo scongelamento). Assicurati che le colonie siano sane, con bordi lisci e lucidi e una differenziazione minima (Figura 2B).

1. Preparare le piastre rivestite di matrice a membrana del seminterrato (piastre da 24 pozzetti o 6 pozzetti) un giorno prima del giorno 0, se necessario. Porta i piatti a RT all'inizio della differenziazione.
2. Rendere il giorno 0-1 medio di differenziazione secondo necessità.
3. Aspirare l'E8 dal confluente, pronto per dividere gli hPCS, e lavare il piatto 2x con 1x PBS.
4. Aggiungere 7 mL di EDTA 0,25 M per piastra da 100 mm, incubare a 37 °C, 5% CO₂, per 15 min.
   nota: A questo punto, il trattamento con EDTA viene prolungato per disperdersi in singole cellule.
5. Staccare tutte le hPSC (dovrebbero essere galleggianti) e trasferirle in una provetta da 50 mL. Aggiungere la stessa quantità o più di 1x PBS della soluzione EDTA per diluire l'EDTA.
6. Centrifugare a 200 x g per 4 min.
7. Scartare il surnatante, aggiungere 1 mL di terreno di differenziazione al giorno 0-1 e pipettare per omogeneizzare le cellule. Seguire aggiungendo altro terreno e quindi mescolare per diluire la soluzione cellulare a una concentrazione ideale per contare le cellule.
   nota: Non diluire eccessivamente la soluzione cellulare. Per iniziare, le cellule di una piastra piena da 100 mm devono essere diluite in 5 mL di terreno.
8. Contare il numero di cellule utilizzando un contatore di cellule automatico o un emocitometro.
9. Diluire la soluzione cellulare secondo necessità per raggiungere 125.000 cellule/cm² in un volume finale basso (ad esempio, 2 mL per pozzetto per una piastra a 6 pozzetti o 500 μL per pozzetto per una piastra a 24 pozzetti).
   nota: Un volume basso aiuta le cellule ad attaccarsi più velocemente.
10. Aspirare tutta la soluzione della matrice della membrana basale dalle piastre rivestite e placcare la soluzione cellulare nei pozzetti.
11. Incubare a 37 °C, in CO₂ al 5%.

3. Induzione delle cellule della cresta neurale (dal giorno 1 al giorno 10, Figura 1A)

1. Il giorno 1, alimentare le cellule con un terreno di differenziazione al giorno 0-1 (3 mL per pozzetto per piastre da 6 pozzetti e 1 mL per pozzetto per piastre da 24 pozzetti).
2. Il giorno 2 alimentare le cellule con un terreno di differenziazione dal giorno 2 al giorno 10 (3 mL per pozzetto per piastre da 6 pozzetti e 1 mL per pozzetto per piastre da 24 pozzetti).
3. D'ora in poi, le cellule dovrebbero essere alimentate a giorni alterni fino al giorno 10 (cioè, il giorno successivo di alimentazione sarà il giorno 4).
   nota: Dal giorno 6 in poi, le creste NC dovrebbero essere rilevate (Figura 1B). Per verificare se è in corso il differenziamento, si consiglia di effettuare una coltura di differenziazione parallela in pozzetti più piccoli (cioè 24 pozzetti), che possono essere colorati per SOX10/AP2a e utilizzati per l'espressione genica marcatore lungo il tempo di differenziazione (Figura 1B, C).
4. Se si ordinano le celle, procedere alla sezione 4. In caso contrario, procedere alla sezione 5.

4. Smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS) per il marcatore della cresta neurale CD49D e aggregazione di cellule NC negli sferoidi

NOTA: Per la selezione FACS, i campioni devono essere conservati su ghiaccio e non devono essere esposti alla luce dopo la colorazione fino alla selezione.

1. Preparare il buffer FACS se le celle sono ordinate.
2. Preparare il medio sferoidale del giorno 10-14.
3. Il giorno 10, rimuovere il mezzo e lavare 1 volta con 1 PBS.
4. Aggiungere la soluzione di dissociazione (vedere la Tabella dei materiali) a 2 mL per pozzetto per una piastra a 6 pozzetti o 1 mL per pozzetto per una piastra a 24 pozzetti e incubare a 37 °C, 5% CO₂ per 20 min.
5. Estrarre tutte le hPSC e trasferirle in una provetta da 50 mL.
6. Riempire il resto della provetta con tampone FACS e centrifugare a 200 x g per 4 min.
   nota: Ogni provetta da 50 mL può contenere fino a 20 mL o meno di soluzione cellulare. Il volume del tampone FACS deve essere sufficientemente alto da neutralizzare la soluzione di dissociazione.
7. Scartare il surnatante, risospendere le cellule con la quantità appropriata di tampone FACS (~2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti) e contare per determinare il numero di cellule.
8. Preparare i seguenti campioni.
   1. Campione 1 (controllo non colorato): 1 x 10⁶ cellule in 400 μL di tampone FACS. Filtrare le celle attraverso un tappo filtrante da 20 μm e mantenere la provetta sul ghiaccio.
   2. Campione 2 (solo controllo DAPI): 1 x 10⁶ cellule in 400 μL di tampone FACS contenente 0,5 ug/mL di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Filtrare le cellule attraverso una provetta FACS con un tappo filtrante e mantenere la provetta sul ghiaccio.
   3. Campione 3 (marcato con CD49D): sospendere il resto delle cellule con il tampone FACS contenente l'anticorpo CD49D coniugato con ficoretrina/cianina 7 (PE/Cy7) (5 μL per 1 x 106 cellule per 100 μL di tampone FACS) in una provetta da 15 mL e incubare su ghiaccio per 20 minuti.
9. Riempire le provette con il tampone FACS e centrifugare a 200 x g per 4 min.
10. Eliminare il surnatante e risospendere ogni 5-10 x 10⁶ cellule in 1 mL di tampone FACS contenente 0,5 ug/mL di DAPI secondo le istruzioni del produttore.
11. Filtrare le cellule attraverso il tubo FACS con il tappo del filtro e mantenere il tubo sul ghiaccio.
12. Preparare le provette FACS di raccolta contenenti 2 mL di tampone FACS.
13. Ordina la macchina FACS con laser in grado di rilevare DAPI e PE-Cy7 per isolare la popolazione CD49D⁺.
14. Dopo l'ordinamento, contare le celle ordinate.
15. Centrifugare tutte le cellule selezionate e risospendere in terreno sferoidale al giorno 10-14 fino a una concentrazione finale di 0,5 x 10⁶ cellule per 500 μl di terreno.
16. Piastra 0,5 x 10⁶ celle per pozzetto in piastre da 24 pozzetti con attacco ultrabasso.
17. Incubare le cellule a 37 °C, in CO₂ al 5%.

5. Aggregazione di cellule NC in sferoidi

1. Se non si utilizza il FACS per isolare le cellule NC e invece di aggregarle direttamente in sferoidi, preparare prima le cellule come descritto nei passaggi da 4.2 a 4.5.
2. Riempire il resto della provetta con 1x PBS e centrifugare a 200 x g per 4 min.
3. Scartare il surnatante, risospendere le cellule con una quantità appropriata di terreno sferoidale al giorno 10-14 (ad esempio, ~2 mL di terreno per pozzetto per una piastra a 6 pozzetti) e contare per determinare il numero di cellule.
4. Diluire le cellule nel terreno sferoidale del giorno 10-14 a 0,5 x 10⁶ cellule per 500 μL di terreno.
5. Piastra 500 μl di sospensione cellulare per pozzetto in piastre da 24 pozzetti con attacco ultrabasso.
6. Incubare le cellule a 37 °C, in CO₂ al 5%.

6. Mantenimento degli sferoidi NC e induzione del progenitore simpatico (dal giorno 10 al giorno 14, Figura 3A)

1. Opzione 1: cultura sferoidale minima
   1. Il giorno 11, aggiungere 500 μl di terreno sferoidale del giorno 10-14 agli sferoidi NC senza aspirare il terreno esistente dal giorno 10. Incubare a 37 °C, in CO₂ al 5%.
   2. Il giorno 12, inclinare la piastra per accumulare gli sferoidi NC su un lato dei pozzetti. Aspirare e scartare con cura quanto più terreno possibile e somministrare con 1 ml di terreno sferoidale al giorno 10-14.
   3. Continua a nutrire le cellule ogni giorno fino al giorno 14.
   4. Facoltativo: se gli sferoidi si aggregano e generano un grande grumo, utilizzare una pipetta per rompere i grumi di sferoidi. Ciò garantisce anche che i singoli sferoidi non diventino troppo grandi.
      nota: L'intervallo di dimensioni ideali degli sferoidi dovrebbe essere di circa 100-500 μm. All'interno di questo intervallo, la dimensione dei singoli sferoidi non è critica. Tuttavia, la morfologia, come i bordi lisci e chiari (Figura 2 e Figura 4) è importante per un ulteriore successo. Al giorno 14, ogni piastra a 24 pozzetti contiene idealmente circa 50-60 sferoidi di diverse dimensioni all'interno dell'intervallo di dimensioni sopra menzionato.
2. Opzione 2: Espansione della cultura degli sferoidi
   1. Il giorno 15, per conservare gli sferoidi NC, somministrare con 1,5 mL di terreno sferoidale del giorno 10-14 contenente 0,5 μM di RA. Incubare a 37 °C, 5% CO₂.
      nota: L'AR deve essere aggiunto fresco ad ogni poppata e conservato sempre a -80 °C.
   2. D'ora in poi, somministrare a giorni alterni fino al giorno 28 e poi continuare con la placcatura degli sferoidi (sezione 7.1).
      nota: Gli sferoidi in crescita vengono divisi circa 1 volta alla settimana pipettandoli con una pipetta da 1 ml per romperli. Sono divisi con un rapporto approssimativo di 1:2-1:4. Entro il periodo di espansione di 2 settimane, le celle dovrebbero quadruplicare di numero.

7. Differenziazione e maturazione dei neuroni simpatici (SymN) (Opzione 1: dopo il giorno 14; Opzione 2: dopo il giorno 28)

1. Placcatura di sferoidi in piatti normali
   1. Preparare piastre a 24 pozzetti rivestite in PO/LM/FM.
   2. Preparare un terreno symN contenente 0,125 μM di AR (aggiungere fresco a ogni poppata) e 10 μM di Y27632 (solo giorno 14).
   3. Il giorno 14, inclinare la piastra per accumulare sferoidi NC su un lato dei pozzetti. Aspirare e scartare con cura quanto più terreno possibile e somministrare con 1 mL di terreno symN.
   4. Rimuovere LM/FN dalle piastre rivestite.
   5. Dividere e placcare ogni pozzetto dalla piastra a 24 pozzetti in 4 pozzetti separati della nuova piastra rivestita a 24 pozzetti. Ogni pozzetto originale avrà 1 mL, contenente ~50-60 sferoidi. Questo produce 250 μl, contenenti circa 10-15 sferoidi per ogni pozzetto sulla nuova piastra.
   6. Aggiungere 250 μl di terreno aggiuntivo per pozzetto.
      nota: Questa è una divisione di 1:4; Assicurarsi che gli sferoidi siano distribuiti correttamente all'interno della soluzione in modo che la divisione sia relativamente uniforme. Il numero di sferoidi non viene conteggiato perché il numero finale non influisce sul successo della generazione di symN.
   7. Incubare a 37 °C, 5% CO₂.
   8. Il giorno 15 (o il giorno 29 per l'opzione 2), somministrare sostituendo tutto il terreno con 1 mL di terreno symN contenente 0,125 μM di RA. D'ora in poi, i neuroni dovrebbero essere alimentati ogni 2 giorni fino al giorno 20 (o al giorno 35 per l'opzione 2).
   9. Dopo il giorno 20 (o il giorno 35 per l'opzione 2), i neuroni devono essere alimentati sostituendo con cura solo la metà del terreno esistente (500 μL). D'ora in poi, dai da mangiare ogni settimana a meno che il terreno non diventi rapidamente giallo.
   10. Continua a nutrire settimanalmente fino al punto di tempo desiderato.
       NOTA: i symN tendono ad aggregarsi in strutture simili ai gangli e tendono a staccarsi dai piatti di coltura. Per evitare ciò, si raccomandano mezze poppate e una manipolazione minima.

Risultati

Figura 1: Induzione NC. (A) Cronologia e trattamenti per l'induzione di NC dal giorno 0 al giorno 10. (B) La morfologia e la formazione delle creste NC sono state monitorate ogni 2 giorni mediante microscopia a campo chiaro. Le cellule in ogni momento dopo il giorno 2 sono state co-colorate per AP2A (rosso) e SOX10 (verde). Tutte le immagini in immunofluorescenza son...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre per colture cellulari da 100 mm	Falcone	353003
Provette coniche per coltura tissutale da 15 mL	VWR/Corning	89039-664
Piastre per coltura tissutale a 24 pozzetti	Falcone	353047
Piastre di fissaggio ultra-basse a 24 pozzetti	Corning	07 200 601 e 07 200 602
incubatore per colture tissutali 5% CO2/20% O2	Thermo Fisher/Life Technologies	Heracell VIOS 160i
Provette coniche per coltura tissutale da 50 ml	VWR/Corning	Codice 89039-656
Piastre per coltura tissutale a 6 pozzetti	Costar	3516
Accutase	Innovazione Tecnologie Cellulari	AT104500	Soluzione di dissociazione cellulare
Anticorpo anti-AP2a	Abcam	ab108311	Ostia: Coniglio; diluizione 1:400
Anticorpo anti-Ascl1	BD Pharmingen	556604	Ospite: IgG1 di topo; diluizione 1:200
Anticorpo anti-CD49D	BioLeggenda	304313	Ospite: IgG1 di topo; 5 μl/milione di cellule in volume di 100 μl
Anticorpo anti-CD49D (isotipo)	BioLeggenda	400125	Ospite: IgG1 di topo; 5 μl/milione di cellule in volume di 100 μl
Anticorpo anti-DAPI	sigma	D9542	Diluizione 1:1000
Anticorpo anti-DBH	Immunostar	Codice 22806	Ostia: Coniglio; diluizione 1:500
Anticorpo anti-GFP	Abcam	ab13970	Ostia: Pollo; diluizione 1:1000
Anticorpo anti-HOXC9	Santa Cruz Biotecnologia	SC-365692	Ospite: IgG1 di topo; diluizione 1:100
Anticorpo anti-NET1	Mab	NET17-1	Host: Mouse; diluizione 1:1000
Anticorpo anti-PRPH	Santa Cruz Biotecnologia	SC-377093/H0112	Ospite: IgG2a di topo; diluizione 1:200
Anticorpo anti-SOX10	Abcam	ab50839	Host: Mouse; diluizione 1:100
Anticorpo anti-TH	Pel-Freez	P40101- 150	Ostia: Coniglio; diluizione 1:500
acido ascorbico	sigma	A8960-5G	Concentrazione di magazzino: 100 mM
Supplemento B27	Thermo Fisher/Life Technologies	Codice 12587-010	Concentrazione delle scorte: 50x
BDNF	Sistemi di ricerca e sviluppo	248-BD	Concentrazione di riserva: 10 μg/mL
BMP4	Sistemi di ricerca e sviluppo	314-BP	Concentrazione stock: 6 mM
Contatore di celle	Thermo Fisher/Life Technologies	Contessa II
Vetrini per camera di conteggio delle cellule	Invitrogen	Codice: C10312
centrifuga	Eppendorf	57021 e 5424R
CHIR99021	Sistemi di ricerca e sviluppo	4423	Concentrazione stock: 6 mM
Crio-fiala	Thermo Fisher/Life Technologies	375353
dbcAMP	sigma	D0627	Concentrazione di magazzino: 100 mM
DMEM	Thermo Fisher/Life Technologies	Codice 10829-018	Concentrazione delle scorte: 1x
DMEM/F12	Thermo Fisher/Life Technologies	Codice 11330-057	Concentrazione delle scorte: 1x
Dmso	Thermo Fisher/Life Technologies	BP231-100
E6 medio	Gibco	Codice A15165-01
E8 medio	Gibco	Codice A15169-01	Concentrazione delle scorte: 1x
Supplemento E8	Gibco	Codice A15171-01	Concentrazione delle scorte: 50x
Edta	sigma	ED2SS	Concentrazione di impasto: 0,5 M
Macchina FACS	Beckman Coulter	CytoFLEX (per FACS)
Macchina FACS	Beckman Coulter	MoFlo Astrios EQ (per lo smistamento)
Tubi FACS (tappo filtro blu)	Falcone	352235
Provette FACS (tappo bianco)	Falcone	352063
Siero fetale bovino (FBS)	Atlanta Biologicals	S11150
GDNF	PeproTech	450	Concentrazione di riserva: 10 μg/mL
Geltrex	Invitrogen	A1413202	Matrice della membrana basale; Concentrazione delle scorte: 100x
hPSC	Thomson et al., (1998)	WA09
hPSC	Oh et al. (2016)	H9-PHOX2B::eGFP
Fibronectina umana (FN)	VWR/Corning	Codice 47743-654	Concentrazione di riserva: 1 mg/mL
L-glutammina	Thermo Fisher/Gibco	Codice 25030-081	Concentrazione del magazzino: 200 mM
Serbatoio LN	Sistemi biogenici personalizzati	V-1500AB
Lamina murina I (LM)	Sistemi di ricerca e sviluppo	Codice 3400-010-01	Concentrazione di riserva: 1 mg/mL
Integratore N2	Thermo Fisher/Life Technologies	Codice 17502-048	Concentrazione delle scorte: 100x
Terreno neurobasale	Gibco	Codice 21103-049	Concentrazione delle scorte: 1x
NGF	PeproTech	450-01	Concentrazione di riserva: 25 μg/mL
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	Codice 14190-136	Concentrazione delle scorte: 1x
Bromidrato di poli-L-ornitina (PO)	sigma	P3655	Concentrazione di riserva: 15 mg/mL
Primocin (antibiotici)	InvivoGen	ANTPM1	Concentrazione di riserva: 50 mg/mL
Macchina qPCR	Laboratori Bio-Rad	C1000 Touch
Piastre qPCR	Laboratori Bio-Rad	HSP9601
FGF2 ricombinante	Sistemi di ricerca e sviluppo	233-FB/CF	Concentrazione di riserva: 10 μg/mL
Acido retinoico	sigma	Codice: R2625	Concentrazione del magazzino: 1 mM
SB431542	Tocris/Sistemi di ricerca e sviluppo	Anno 1614	Concentrazione stock: 10 mM
Tripan blu	Corning	MT-25-900-CI
Vitronectina (VTN)	Thermo Fisher/Life Technologies	Codice: A14700	Concentrazione di riserva: 0,5 mg/mL
Bagnomaria	VWR/Corning	706308
Y27632	Sistemi di ricerca e sviluppo	Ore 1254	Concentrazione stock: 10 mM