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1. Preparativi
- Preparare 10 ml di terreno di dissezione e aggiungere 200 μl di penicillina-streptomicina 100x in 9,8 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium F12 (DMEM/F12).
- Preparare la soluzione di L-cisteina: a 10 ml di acqua per la coltura tissutale e aggiungere 120 mg di L-cisteina. Conservare la soluzione di L-cisteina a 4 °C per un massimo di 2 settimane o in aliquote a -20 °C per un massimo di 1 anno.
- Preparare la soluzione di DNasi I: a 1 ml di acqua per la coltura tissutale, aggiungere 10 mg di DNasi I. Conservare la soluzione di DNasi I a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
- Preparare la soluzione di papaina: per preparare la soluzione di papaina, aggiungere 100 μl di papaina (circa 140 unità), 100 μl di DNasi I (1%) e 200 μl di L-cisteina (12 mg/ml) in 5 mL di DMEM/F12. Preparare ogni volta la soluzione di papaina e sterilizzarla con un filtro a pori da 0,22 μm prima dell'uso.
- Preparare la soluzione di lavaggio: per preparare 100 ml di soluzione di lavaggio, aggiungere 650 μl di glucosio al 45%, 500 μl di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico, HEPES 1 M e 5 ml di siero fetale bovino (FBS) in 93,85 ml di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) 1x. Sterilizzare la soluzione di lavaggio con un filtro poroso da 0,22 μm prima dell'uso. Conservare la soluzione di lavaggio a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
- Preparare la soluzione di insulina: per preparare 2 ml di soluzione di insulina, aggiungere una goccia di 25 μl di idrossido di sodio 10 N (NaOH) e 100 mg di insulina in 2 ml di acqua per la coltura dei tessuti.
- Preparare soluzioni per il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita dei fibroblasti (FGF): Sciogliere entrambi i mitogeni in DMEM/F12 a una concentrazione di 100 μg/ml. Conservare in aliquote da 10 μl a -20 °C.
- Preparare i terreni B-27 e N-2: conservare gli integratori di B-27 e N-2 a -20 °C rispettivamente in aliquote da 500 μl e 1 ml.
- Preparare il terreno della condizione di differenziazione Z: per preparare 100 ml di terreno della condizione di differenziazione Z, aggiungere 40 μl di insulina (50 mg/ml), 500 μl di B-27, 1 ml di N-2, 650 μl di glucosio al 45% e 1 ml di 100 x penicillina-streptomicina in 97,81 ml di DMEM/F12. Prima dell'uso, sterilizzare il mezzo di differenziazione Z con un filtro con pori di 0,22 μm. Conservare il terreno di differenziazione Z a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
- Preparare il terreno in condizione Z: per preparare 50 ml di terreno in condizione Z, aggiungere 10 μl di EGF e 10 μl di FGF in 50 ml di terreno sterile in condizioni di differenziazione Z (20 ng/ml). Conservare il terreno in condizioni Z a 4 °C per un massimo di 1 settimana.
- Preparare la soluzione di rivestimento per la coltura di differenziazione: per 5 ml di soluzione di rivestimento extracellulare, aggiungere 100 μl della soluzione di matrice extracellulare (ad es. Matrigel) in 4,9 ml di DMEM/F12. Scongelare la soluzione di matrice extracellulare a 4 °C con ghiaccio. Una volta scongelato, conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Dissezione del cervello adulto del pesce zebra
- Preparare un letto di dissezione riempiendo una piastra di Petri da 100 mm x 15 mm con impacchi di ghiaccio in gel. Quindi posizionare il coperchio sulla capsula di Petri e incubare a -20 °C fino a quando il gel non si congela. Sopra il coperchio posizionare un quadrato di carta da filtro pulita e avvolgere sia la carta da filtro che la capsula di Petri con una pellicola di plastica.
- Pulire e sterilizzare tutti gli strumenti di microdissezione con etanolo al 70% o calore prima di ogni utilizzo. Posizionare tutti gli strumenti di dissezione sterilizzati vicino al microscopio da dissezione e, subito prima dell'eutanasia, posizionare il letto di dissezione sotto il microscopio con illuminazione a fibre ottiche.
- Raccogli 2 pesci zebra adulti per una preparazione di neurosfere dell'intero cervello; e da 3 a 4 pesci zebra per generare neurosfere da regioni cerebrali sezionate.
- Eutanasia del pesce zebra adulto (8-12 mesi) utilizzando un protocollo approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali. Successivamente, immergere il pesce in etanolo al 75% per 5-10 secondi e posizionarlo rapidamente nel letto di dissezione seguito dalla decapitazione a livello delle branchie utilizzando una lama chirurgica.
- Per l'eutanasia degli animali, somministrare un sovradosaggio (300 mg/L) di tricaina metano sulfonato fino a quando il battito cardiaco dell'animale non rallenta gradualmente e la circolazione si interrompe, quindi immergere in acqua ghiacciata.
- Girare la testa con il lato dorsale verso il basso e usando le forbici fare un taglio longitudinale dal lato tagliato alla bocca. Usando la pinza esponi la base del cranio e rimuovi tutto il tessuto adiacente. Taglia le pareti laterali del cranio dall'inizio del midollo spinale verso il tectum.
- Usando le forbici, tagliare e rimuovere i nervi ottici e quindi rimuovere entrambi i lati della parte più laterale del cranio a livello del tetto. Girare la testa con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Usando una pinza, stacca il resto della parte più apicale del cranio.
- Trasferire il cervello insieme alla parte rimanente del cranio in un nuovo piatto con il mezzo di dissezione (1.1). Pulisci il tessuto cerebrale nel mezzo di dissezione usando il manico in plastica del micro coltello, mantenendo intatte tutte le strutture cerebrali.
- Da questo punto, continuate il protocollo utilizzando l'intero cervello del pesce zebra.
- In alternativa, adattare questo protocollo a specifiche regioni cerebrali per generare neurosfere dall'intero cervello del pesce zebra o dal telencefalo, dal tectum/diencefalo o dal cervelletto sezionato con un bisturi fresco. Utilizzare una linea neurale transgenica fluorescente neurale specifica per sezionare la regione cerebrale di interesse secondo la Figura 1.
3. Dissociazione di singole cellule del cervello adulto
- Eseguire tutti i lavori successivi in una cabina di sicurezza biologica. Trasferire il tessuto cerebrale in una provetta da 1,5 ml contenente 800 μl di terreno di dissezione (preparato al punto 1.1). Rimuovere il mezzo di dissezione mediante pipettaggio, senza toccare il tessuto cerebrale.
- Aggiungere 500 μl di soluzione di papaina (fase 1.4) e digerire il tessuto cerebrale a 37 °C per 10 minuti. Non incubare per più di 15 minuti in quanto potrebbe ridurre la vitalità cellulare.
- Dopo l'incubazione, trasferire il tessuto cerebrale con 500 μl di soluzione di papaina in una provetta conica da 15 ml utilizzando una punta di pipetta da 1.000 μl tagliata a ~0,25 pollici dal fondo. Dissociare delicatamente il tessuto cerebrale pipettando lentamente su e giù 10 volte con la stessa punta. Non pipettare su e giù più di 15 volte e non generare bolle d'aria durante questa fase, poiché potrebbero alterare la vitalità cellulare.
- Incubare nuovamente il tessuto cerebrale a 37 °C per 10 minuti, quindi pipettare su e giù 10-13 volte utilizzando un puntale regolare da 1.000 μl non tagliato. Non pipettare su e giù più di 15 volte, per evitare la morte cellulare.
- Arrestare la digestione enzimatica aggiungendo 2 ml di soluzione di lavaggio (fase 1.5) e centrifugare la sospensione cellulare a 800 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Decantare accuratamente il surnatante e risospendere il pellet nella soluzione rimanente picchiettando energicamente la provetta con un dito e quindi pipettando su e giù con un puntale normale da 1.000 μl. Quindi, aggiungere 2 ml di soluzione di lavaggio.
- A questo punto, verificare al microscopio che sia stata ottenuta una sospensione a singola cellula. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 800 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet utilizzando 1 ml di terreno fresco in condizione Z (passaggio 1.10).
- Colorare le cellule utilizzando il blu di tripano e contare le cellule viventi utilizzando un emocitometro escludendo le cellule morte blu. Preparare una piastra a 24 pozzetti con 200 μl di sospensione cellulare e 300 μl di terreno fresco in condizione Z in ciascun pozzetto. Cellule di semina con una densità di ~500 cellule/μl. Mantenere le cellule coltivate in un incubatore a 30 °C in CO2 al 5%, poiché le neurosfere derivate dal cervello di zebrafish non crescono bene a 37 °C.
4. Generazione di neurosfere primarie
- Dopo 1 giorno in vitro (DiV1), osservare al microscopio la sospensione di una singola cellula ottenuta dall'intero cervello adulto e notare se i detriti si sono accumulati al centro del pozzetto. Rimuovere con cura eventuali detriti pipettando circa 100 μl di terreno (meno se possibile). Aggiungere quindi 100 μl di terreno fresco in condizioni Z. In questo momento devono essere osservate sospensioni a cellula singola (Figura 2A DiV1).
- Dopo 2 giorni in vitro (DiV2), espandere le cellule in coltura. Utilizzando una pipetta da 1.000 μl con il puntale tagliato, raccogliere e trasferire 250 μl di sospensione cellulare da ciascun pozzetto in un nuovo pozzetto. Aggiungere 250 μl di terreno fresco in condizioni Z in tutti i pozzetti. Prima di espandere le cellule in coltura, omogeneizzare la sospensione molto delicatamente pipettandola su e giù in tutto il pozzetto.
- Ripetere i passaggi 4.1 e 4.2 per i successivi 4 giorni in vitro (DiV4). Un progressivo aumento delle dimensioni delle neurosfere dovrebbe essere visibile al centro e ai bordi del pozzetto in corrispondenza di DiV3 e DiV4 (Figura 2B e C).
nota: Le neurosfere primarie possono essere elaborate per il passaggio o la differenziazione per valutare la multipotenza. In alternativa, possono essere processati per nucleofezione o lipo-trasfezione per caratterizzare il ruolo di geni specifici durante il processo di differenziamento.
5. Passaggio delle neurosfere primarie
- Rimuovere 250 μl di coltura tissutale da ciascun pozzetto e dissociare meccanicamente le neurosfere DiV4 con una pipetta da 1 ml. Non pipettare su e giù troppo rapidamente poiché la formazione di bolle d'aria può aumentare la morte cellulare.
- Contare le cellule con un emocitometro e distribuire 800 cellule/μl in 250 μl di surnatante di coltura primaria in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
- Aggiungere 250 μl di terreno Z-condition a ciascun pozzetto.
- Dopo 2 giorni in vitro (DiV2), espandere le cellule in coltura come riportato nei passaggi 4.2 e 4.3.
6. Differenziazione delle neurosfere primarie
- Sterilizzare i bicchieri di copertura immergendoli in etanolo al 70% per 10 minuti, quindi asciugare i bicchieri di copertura a RT inserendoli in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
- Aggiungere 300 μl di soluzione di rivestimento extracellulare (passaggio 1.11) al centro del vetro di copertura in modo tale che possa espandersi ampiamente e coprire l'intero vetro di copertura. Quindi, incubare a 37 °C per 1 ora (utilizzando l'incubatore per colture cellulari umidificato).
- Rimuovere la soluzione di rivestimento extracellulare dopo l'incubazione e asciugare il vetro di copertura per 2 ore a 37 °C.
- Rimuovere 250 μl di coltura tissutale da ciascun pozzetto. Dissociare meccanicamente tutte le neurosfere primarie DiV4 per pozzetto con una pipetta da 1 ml (con punta più larga) pipettando su e giù.
- Seminare sospensioni di cellule della neurosfera dissociate a una densità cellulare di 4 x 103 cellule/ml su vetri di copertura rivestiti di matrice extracellulare precedentemente preparati (fase 6.1-6.3) e conservare per almeno 30 minuti, a 30 °C in CO2 al 5%, fino a quando non si attaccano al substrato. Quindi, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere rapidamente 1 ml di terreno di differenziazione Z fresco preriscaldato (fase 1.9) prima di coltivare le cellule per 24 ore a 30 °C in CO2 al 5%.
- Ogni due giorni, sostituire metà del mezzo della condizione di differenziazione Z durante il periodo di differenziazione cellulare.
