Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Generazione di organoidi cerebrali (23 giorni)
- Inizio del neuroectoderma (5 giorni)
NOTA: I seguenti punti devono essere considerati prima dell'inizio della differenziazione. Il metodo di riprogrammazione (basato su virus lentivirali, sendai, episomici o microRNA, ecc.) per ottenere iPSC umane dovrebbe idealmente essere lo stesso per tutte le linee di iPSC del paziente e di controllo. Sono disponibili vari kit di riprogrammazione e istruzioni basate sui protocolli pubblicati. La qualità delle linee iPSC umane è la chiave per ottenere una differenziazione ottimale. Monitora la morfologia delle colonie e delle cellule con un microscopio e convalida la pluripotenza testando l'espressione di marcatori come Oct3/4, Nanog o TRA-1-60.
- Coltura di iPSC umane in condizioni prive di alimentazione nel terreno A su una piastra rivestita con matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS).
nota: Coltivare iPSC umane senza alimentatore e senza siero per mantenere una condizione di coltura definita ed evitare un ulteriore passaggio per la rimozione delle cellule di alimentazione embrionale di topo (MEF) prima dell'inizio della differenziazione. Il numero di passaggi ottimale per le iPSC umane per iniziare la differenziazione varia dal passaggio 15 dopo la riprogrammazione al passaggio 70 in totale. Durante il passaggio, staccare le colonie di hiPSC man mano che le cellule si aggregano utilizzando una soluzione di distacco cellulare appropriata con basso stress meccanico e una pipetta sierologica da 2 ml per trasferire gli aggregati in un nuovo piatto. Evitare la dissociazione in singole cellule, poiché ciò potrebbe indurre la differenziazione e l'apoptosi nella maggior parte delle linee iPSC. È stato riportato che il passaggio a lungo termine di singole cellule potrebbe aumentare le alterazioni genomiche nelle iPSC umane. Evitare le procedure di distacco delle cellule, che richiedono una fase di centrifugazione per rimuovere la soluzione di distacco, in quanto ciò riduce la vitalità complessiva delle iPSC. Testare regolarmente tutte le colture per verificare la presenza di contaminazioni microbiche, in particolare di micoplasmi, perché ciò potrebbe alterare la qualità delle iPSC e la loro capacità di differenziazione.
- Rivestire una piastra di coltura tissutale da 60 mm con matrice EHS secondo le istruzioni del produttore.
- Scongelare un'aliquota di 1 x 106 iPSC umane. Seminare le iPSC in una piastra di coltura tissutale da 60 mm rivestita con matrice EHS e contenente 5 mL di terreno A (vedere la Tabella dei materiali). Cambia il terreno ogni giorno e passa dopo 5-7 giorni quando le celle raggiungono ~80% di confluenza.
nota: Passaggio delle iPSC scongelate all'80% di confluenza utilizzando metodi standard, come il distacco senza enzimi delle colonie, almeno una volta prima di iniziare la differenziazione. In breve, rimuovere il terreno iPSC, lavare una volta le cellule con il terreno di coltura Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) preriscaldato a 37 °C e incubare le iPSC seguendo le istruzioni del produttore utilizzando il reagente A (vedere la tabella dei materiali). Non superare il tempo di incubazione raccomandato per evitare la dissociazione in singole cellule. Le iPSC umane dovrebbero essere staccate e galleggianti come aggregati, non come singole cellule. Possono quindi essere trasferiti su nuove piastre rivestite con matrice EHS; ad esempio, gli aggregati iPSC di una parabola da 60 mm possono essere distribuiti a 4 nuove parabole da 60 mm.
b. Verificare la presenza di micoplasma con un kit di rilevamento del micoplasma secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare solo iPSC prive di micoplasma, poiché il micoplasma può alterare la capacità di differenziazione delle iPSC.
- Dissociare le iPSC (80% confluenti) e preparare una sospensione unicellulare utilizzando il reagente B
- Lavare le iPSC una volta con DMEM/F12 preriscaldato (37 °C).
- Aggiungere il reagente B preriscaldato (ad es. 1 mL in una piastra da 60 mm) e incubare le iPSC per 5 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Scorri 20 volte con la punta del dito sul lato e sul fondo del piatto per staccare le iPSC. Verificare il distacco delle cellule al microscopio.
- Pipettare la sospensione cellulare su e giù nella piastra 5 volte con una micropipetta da 1 mL.
- Aggiungere 3 mL di terreno A per diluire 1 mL di reagente B e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL.
- Centrifugare delicatamente le iPSC (500 x g) per 4 minuti a temperatura ambiente.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno B e contare il numero di cellule con un emocitometro.
nota: Prestare attenzione all'uso del solo mezzo B per la risospensione. Evitare l'uso del terreno A, poiché contiene una concentrazione troppo alta di bFGF, che potrebbe inibire la differenziazione.
- Diluire la sospensione cellulare a 4,5 x 105 cellule per mL nel terreno B integrato con 10 μM di inibitore della proteina chinasi rho-associata (Y-27632).
- Aggiungere 100 μl per pozzetto in una piastra a 96 pozzetti non aderente, con fondo a V.
nota: Assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente nella sospensione agitando la provetta ogni volta prima di prelevare porzioni da 100 μl. È importante che ogni pozzetto contenga un numero di cellule equivalente per ottenere neurosfere omogenee per dimensioni e forma (superfici rotonde e definite).
- Centrifugare delicatamente la piastra con le cellule a 500 x g e temperatura ambiente per 3 minuti e incubare a 37 °C e 5% di CO2.
- Cambiare il terreno ogni giorno rimuovendo 50 μl e aggiungendo 50 μl di terreno B fresco in ciascun pozzetto per i successivi 5 giorni.
2. Incorporamento di neurosfere nella matrice EHS (4 giorni)
- Preparare il terreno della neurosfera mescolando quanto segue: miscela 1:1 di DMEM/F12 e terreno C (v/v), integratore 1:200 (v/v) 1, integratore 1:100 (v/v) 2 senza (senza) vitamina A, 1:100 L-glutammina, 0,05 mM di aminoacidi non essenziali (MEM), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 1,6 g/L di insulina e 0,05 mM di β-mercaptoetanolo.
- Raccogliere le neurosfere con una micropipetta da 200 μL utilizzando una punta da ~2 mm precedentemente tagliata con forbici sterili.
- Posizionare le neurosfere a circa 5 mm di distanza l'una dall'altra su una pellicola di paraffina (3 x 3 cm2) in un piatto vuoto da 100 mm e rimuovere con cura la maggior quantità possibile di terreno rimanente.
- Aggiungere una goccia (7 μL) di matrice EHS su ogni singola neurosfera.
- Incubare le gocce di matrice EHS con le neurosfere per 15 minuti in un'incubatrice.
- Lavare accuratamente le neurosfere dal film di paraffina sciacquandole con il mezzo neurosfera. Per il lavaggio, utilizzare una micropipetta da 1 ml e una nuova piastra di Petri da 100 mm contenente 10 ml di terreno neurosferico.
- Incubare le neurosfere per i successivi 4 giorni e aggiungere 2 mL di terreno di neurosfera fresco il giorno 2,
nota: Assicurarsi che i ripiani dell'incubatrice siano piatti in modo che le neurosfere incorporate nella matrice EHS non si aggreghino su un lato del piatto.
3. Organoidi in una coltura rotativa in sospensione (14 giorni)
- Preparare il terreno organoide cerebrale mescolando quanto segue: miscela 1:1 di DMEM/F12 e mezzo C (v/v), integratore 1:200 (v/v), integratore 1:100 (v/v) 2 senza vitamina A, 1:100 L-glutammina, 0,05 mM MEM, 100 U/mL penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 1,6 g/L di insulina, 0,5 μM di dorsomorfina, 5 μM di SB431542, e 0,05 mM β-mercaptoetanolo.
- Aggiungere 100 ml di terreno organoide cerebrale a ciascun pallone attraverso i bracci laterali e metterli in un'incubatrice per il preriscaldamento per almeno 20 minuti.
- Impostare un programma di agitazione a 25 giri/min, secondo le istruzioni del produttore.
nota: Prima di trasferire le neurosfere incorporate nella matrice EHS in fiasche rotanti, assicurarsi che siano tutte separate. Se due o più sono collegati attraverso la matrice EHS, separarli tagliando la matrice di collegamento con un bisturi.
- Trasferire con cautela le neurosfere incluse nella matrice EHS in fiasche contenenti 100 mL di terreno organoidico utilizzando una pipetta sierologica da 2 mL. Utilizzare i bracci laterali del pallone per trasferire le neurosfere nel pallone.
- Posizionare i palloni su una piattaforma di agitazione magnetica in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2; questo è il giorno 0 della coltura degli organoidi.
- Cambiare il terreno una volta alla settimana (o più spesso quando c'è un cambiamento di colore) rimuovendo metà del terreno e aggiungendo la stessa quantità di terreno fresco.
nota: Quando si estraggono i palloni dall'incubatrice, attendere 3-5 minuti per far affondare gli organoidi sul fondo del pallone. Rimuovere il fluido posizionando il puntale della pipetta in vetro (collegato a una pompa) sulla superficie del liquido; Aspirare con cautela il fluido attraverso un'apertura/braccio laterale del pallone. Queste manipolazioni devono essere eseguite sotto la cappa laminare.
