Differenziazione indotta dalla stimolazione elettrica di cellule staminali neurali e progenitrici

Abstract

Fonte: Chang, H. et al., Differenziazione delle cellule precursori neurali indotta da campo elettrico nei dispositivi microfluidici.J. Vis. Exp. (2021)

Questo video dimostra l'uso di un chip microfluidico rivestito di matrice extracellulare per differenziare le cellule staminali neurali e progenitrici o NPC attraverso la stimolazione elettrica. Dopo la semina e l'adesione alla regione rivestita, le NPC crescono e l'applicazione di una corrente continua innesca la loro differenziazione in neuroni, astrociti e oligodendrociti.

Protocollo

1. Progettazione e fabbricazione del chip elettrotattico (MOE) multicanale, otticamente trasparente,

1. Disegna i modelli per i singoli strati di polimetilmetacrilato (PMMA) e il nastro biadesivo utilizzando il software appropriato (Figura 1A, Tabella dei materiali). Tagliare sia i fogli di PMMA che il nastro biadesivo con una macchina laser a_CO2 (Figura 1B).
   1. Accendere il tracciatore laser CO₂ e collegarlo a un personal computer. Aprire il file del modello progettato utilizzando il software.
   2. Posizionare i fogli di PMMA (275 mm x 400 mm) o il nastro biadesivo (210 mm x 297 mm) sulla piattaforma del tracciatore laser (Figura 2A). Focalizzare il laser sulla superficie dei fogli di PMMA o del nastro biadesivo utilizzando lo strumento di messa a fuoco automatica.
   3. Selezionare il laser scriber come stampante, quindi "stampare" il modello utilizzando il laser scriber per avviare l'ablazione diretta sul foglio di PMMA o sul nastro biadesivo e ottenere modelli individuali sul foglio o sul nastro in PMMA (Figura 2B).
2. Rimuovere la pellicola protettiva dai fogli di PMMA e pulire la superficie con azoto gassoso.
   nota: Il disegno del modello in PMMA e la lavorazione diretta del foglio di PMMA sono stati eseguiti secondo un precedente rapporto.
3. Per incollare insieme più strati di fogli di PMMA, impilare tre pezzi di fogli di PMMA da 1 mm (strati 1, 2 e 3) e incollarli a una pressione di 5 kg/cm² in un bonder termico per 30 minuti a 110 °C per formare il gruppo flusso/canale di stimolazione elettrica (Figura 2C).
   nota: Diversi lotti di lastre di PMMA ottenute commercialmente hanno temperature di transizione vetrosa (Tg) leggermente diverse. La temperatura di incollaggio ottimale deve essere testata con incrementi di 5 °C vicini alla Tg.
4. Far aderire 12 pezzi di adattatori alle singole aperture nello strato 1 del gruppo chip MOE con colla cianoacrilica ad azione rapida.
   nota: Gli adattatori sono realizzati in PMMA mediante stampaggio ad iniezione. Le superfici piatte nella parte inferiore servono per il collegamento al chip MOE. Gli adattatori con filettatura femmina da 1/4W-28 sono adatti per il collegamento di spine bianche a tenuta di mano, connettori a fondo piatto o adattatori Luer. Fare attenzione quando si utilizza la colla cianoacrilica ad azione rapida. Evitare di schizzare negli occhi.
5. Disinfettare i substrati in PMMA da 1 mm (strati 1-3), il nastro biadesivo (strato 4) e il PMMA di grado ottico da 3 mm (strato 5) utilizzando l'irradiazione ultravioletta (UV) per 30 minuti prima di assemblare il chip (Figura 1A).
6. Far aderire i substrati in PMMA da 1 mm (strati 1-3) sul PMMA di grado ottico da 3 mm (strato 5) con il nastro biadesivo (strato 4) per completare l'assemblaggio del PMMA (strati 1-5) (Figura 1A).
7. Preparare il vetro di copertura pulito per il montaggio sul chip.
   1. Riempire una diluizione di dieci volte del detersivo in un barattolo di colorazione (vedere la Tabella dei materiali) e pulire il vetro di copertura con questo detergente utilizzando un pulitore a ultrasuoni per 15 minuti.
   2. Sciacquare accuratamente il barattolo di colorazione sotto l'acqua corrente del rubinetto per rimuovere ogni traccia di detersivo.
   3. Continuare a risciacquare con acqua distillata per rimuovere ogni traccia di acqua del rubinetto e ripetere il passaggio 1.7.2 due volte.
   4. Asciugare il vetro di copertura pulito soffiandolo con azoto gassoso.
8. Disinfettare il gruppo PMMA (strati 1-5), il nastro biadesivo (strato 6) e il vetro di copertura (strato 7) utilizzando l'irradiazione UV all'interno di una cabina di biosicurezza per 30 minuti prima di assemblare il chip (Figura 1A).
9. Far aderire il vetro di copertura pulito (Strato 7) al gruppo PMMA (Strati 1-5) con il nastro biadesivo (Strato 6) (Figura 1A).
10. Incubare il chip MOE in una camera a vuoto per una notte; utilizzare il gruppo chip MOE per le procedure successive (Figura 3).

2. Rivestimento di poli-L-lisina (PLL) sul substrato nelle regioni di coltura cellulare

1. Preparare il tubo in politetrafluoroetilene, il connettore a fondo piatto, il connettore a cono, l'adattatore cono-Luer, il tappo bianco a tenuta a dita (chiamato anche tappo), l'adattatore Luer, la siringa Luer lock e il tappo di gomma nera (Figura 4A, Tabella dei materiali). Sterilizzare tutti i componenti di cui sopra in autoclave a 121 °C per 30 minuti.
2. Sigillare le aperture degli adattatori del ponte di agar (Figura 1A) con i tappi bianchi a serraggio dito. Collegare il connettore a fondo piatto al gruppo chip MOE tramite gli adattatori di ingresso e uscita medi (Figura 4B). Collegare l'adattatore cono-Luer ai rubinetti a 3 vie.
3. Aggiungere 2 mL di soluzione PLL allo 0,01% utilizzando una siringa da 3 mL che si collega al rubinetto a 3 vie dell'ingresso del fluido (Figura 4B-).
4. Collegare una siringa vuota da 3 ml al rubinetto a 3 vie dell'uscita del fluido (Figura 4B-).
5. Riempire le regioni di coltura cellulare con la soluzione PLL. Pompare manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro lentamente. Chiudere i due rubinetti a 3 vie per sigillare la soluzione all'interno delle regioni di coltura.
6. Incubare il chip MOE a 37 °C per una notte in un incubatore riempito con il 5% di CO₂ atmosferica.

3. Preparazione della rete del ponte di sale

1. Dopo il passaggio 2.6, aprire i due rubinetti a 3 vie e sciacquare via le bolle nei canali pompando manualmente la soluzione di rivestimento avanti e indietro nel canale utilizzando le due siringhe.
2. Aspirare 3 ml di terreno completo (terreno di mantenimento delle cellule staminali costituito dalla miscela di nutrienti F-12 di Eagle's modificata/Ham's F-12 di Dulbecco), integratore di B-27 al 2%, EGF a 20 ng/mL e bFGF a 20 ng/mL) in una siringa da 3 mL che si collega al rubinetto a 3 vie dell'ingresso del mezzo (Figura 4B- e Figura 4B- ).
3. Aggiungere 3 mL di terreno completo per sostituire la soluzione di rivestimento nelle regioni di coltura cellulare. Collegare una siringa vuota da 5 ml al rubinetto a 3 vie dell'uscita del fluido (Figura 4B-).
4. Preparare la rete del ponte di sale (Figura 5).
   1. Tagliare il tappo di gomma nera per creare uno spazio vuoto e inserire gli elettrodi di argento (Ag)/cloruro d'argento (AgCl) attraverso il tappo di gomma nera e nella siringa Luer lock (Figura 4A).
   2. Sostituire il tappo bianco a tenuta di dita con l'adattatore Luer e iniettare il 3% di agarosio caldo per riempire l'adattatore Luer.
      nota: Per la preparazione dell'agarosio caldo, sciogliere 3 g di polvere di agarosio in 100 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e sterilizzare in autoclave a 121 °C per 30 min.
   3. Collegare la siringa Luer lock all'adattatore Luer. Iniettare il 3% di agarosio caldo attraverso il tappo di gomma nera per riempire la siringa Luer lock utilizzando la siringa con ago. Lasciare raffreddare e solidificare da 10 a 20 minuti affinché l'agarosio.
      nota: Per aumentare la capacità di volume dell'agarosio, la siringa Luer lock è montata sull'adattatore Luer (Figura 4 e Figura 5). Quindi, gli elettrodi grandi vengono inseriti nella siringa Luer lock. L'elettrodo è in grado di fornire una stimolazione elettrica stabile per l'esperimento a lungo termine.

4. Preparazione di mNPC

1. Coltura delle mNPC nel terreno completo in un pallone di coltura cellulare da 25 tonnellate a 37 °C in un incubatore riempito con atmosfera di CO_{2 al} 5%. Subcoltura delle cellule ogni 3-4 giorni ed esecuzione di tutti gli esperimenti con cellule che hanno subito 3-8 passaggi dalla fonte originale.
2. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml e far girare le neurosfere a 100 × g per 5 minuti. Aspirare il surnatante e lavare le neurosfere con 1x PBS di Dulbecco (DPBS). Far girare le neurosfere a 100 × g per 5 min.
3. Aspirare il DPBS 1x e quindi risospendere le neurosfere nel mezzo completo. Mescolare accuratamente e delicatamente.
4. Aggiungere 1 mL di sospensione della neurosfera utilizzando una siringa da 1 mL che si collega al rubinetto a 3 vie dell'uscita (Figura 4B-).

5. Configurazione del sistema microfluidico per la stimolazione a impulsi CC (Figura 6)

1. Installare il chip MOE con semina cellulare sul riscaldatore trasparente all'ossido di indio-stagno (ITO) fissato su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile.
   nota: La temperatura superficiale ITO è controllata da un regolatore proporzionale-integrale-derivativo e mantenuta a 37 °C. Una termocoppia di tipo K è bloccata tra il chip e il riscaldatore ITO per monitorare la temperatura delle regioni di coltura cellulare all'interno del chip. Il chip MOE è installato su uno stadio motorizzato X-Y-Z programmabile ed è adatto per l'acquisizione automatica di immagini time-lapse su singole sezioni di canale. La fabbricazione del riscaldatore ITO e la configurazione del sistema di riscaldamento per colture cellulari sono state descritte in precedenza.
2. Infondere gli mNPC pompandoli manualmente nel chip MOE attraverso l'uscita del fluido. Incubare il chip MOE con semi cellulari sul riscaldatore ITO a 37 °C per 4 ore.
3. Dopo 4 ore, pompare l'intero fluido attraverso il chip MOE attraverso l'ingresso del fluido a una portata di 20 μL/h utilizzando una pompa a siringa.
   nota: Le mNPC vengono coltivate e mantenute nel chip per ulteriori 24 ore prima della stimolazione dei campi elettrici (EF) per consentire l'adesione e la crescita delle cellule. Il liquido di scarto viene raccolto in una siringa vuota da 5 ml collegata al rubinetto a 3 vie dell'uscita, indicato come "rifiuto" nella Figura 6A. La configurazione del sistema microfluidico MOE è mostrata nella Figura 6. Questo sistema microfluidico fornisce un apporto continuo di nutrimento alle cellule. L'intero mezzo fresco viene continuamente pompato nel chip MOE per mantenere un valore di pH costante. Pertanto, le cellule possono essere coltivate all'esterno di un incubatore di CO₂.
4. Utilizzare cavi elettrici per collegare un multiplexer EF al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl sul chip. Collegare un multiplexer EF e un generatore di funzioni a un amplificatore per emettere impulsi CC a onda quadra con un'ampiezza di 300 mV/mm a una frequenza di 100 Hz al 50% dei cicli di lavoro (50% di time-on e 50% di time-off) (Figura 6B).
   1. Collegare i cavi elettrici al multiplexer EF. Collegare i cavi elettrici al chip MOE tramite gli elettrodi Ag/AgCl.
   2. Collegare il multiplexer EF all'amplificatore utilizzando i cavi elettrici. Collegare il generatore di funzioni all'amplificatore e all'oscilloscopio digitale.
      nota: Il multiplexer EF è un circuito che include l'impedenza della camera di coltura nel circuito e collega tutte le singole camere in una rete elettronica parallela. Ciascuna delle tre camere di coltura è collegata elettricamente in serie a un resistore variabile (Vr) e a un amperometro (mostrato come μA nella Figura 6A) nel multiplexer. La corrente elettrica attraverso ciascuna camera di coltura viene variata controllando il Vr e la corrente viene mostrata sull'amperometro corrispondente. L'intensità del campo elettrico in ciascuna regione di coltura cellulare è stata calcolata dalla legge di Ohm, I= σEA, dove I è la corrente elettrica, σ (impostata come 1,38 S·^m-1 per DMEM/F12) è la conducibilità elettrica del mezzo di coltura, E è il campo elettrico e A è l'area della sezione trasversale della camera elettrotattica. Per la dimensione della regione di coltura cellulare mostrata nella Figura 1, la corrente elettrica è di ~87 mA e ~44 mA per impulsi CC e CC al 50% del ciclo di lavoro, rispettivamente.
5. Sottoporre le mNPC a impulsi quadrati CC con un'ampiezza di 300 mV/mm alla frequenza di 100 Hz per 48 ore. Pompare continuamente l'intero terreno a una velocità di 10 μL/h per fornire un'adeguata nutrizione alle cellule e mantenere un valore di pH costante nel mezzo.

Risultati

Figura 1: La configurazione dettagliata del chip elettrotattico multicanale otticamente trasparente.(A) Vista esplosa del gruppo chip MOE. Il chip MOE è costituito da fogli di PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), nastro biadesivo (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adattatori (10 mm x 10 mm x 6 mm), foglio di PMMA di grado ottico (50 mm x 75 mm x 3 mm), nastro biadesivo (24 mm x 60 mm x 0,07 mm), e ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Substrati in PMMA da 1 mm (Strati 1-3)	BHT	K2R20	Polimetilmetacrilato (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
Provetta in plastica da 15 mL	Protech Technology Enterprise Co., Ltd	CT-15-PL-TW	Tubo a fondo conico con tappo, assemblato, presterilizzato
Siringa da 3 ml	TERUMO	DVR-3413	3 mL siringhe per somministrazione orale, senza ago
PMMA di grado ottico da 3 mm (strato 5)	Società CHI MEI	Foglio ACRYPOLY PMMA	PMMA di grado ottico
Rubinetto a 3 vie	NIPRO	NCN-3L	Rubinetto sterile monouso a 3 vie
Siringa da 5 ml	TERUMO	DVR-3410	5 mL siringhe per somministrazione orale, senza ago
adattatore	Dong Zhong Co., Ltd.	Personalizzato	Adattatore in PMMA
agarosio	Sigma-Aldrich	Codice: A9414	Agarosio, bassa temperatura di gelificazione
amplificatore	A.A. Sistemi di laboratorio Ltd	A-304	Amplificatore ad alta tensione
Software AutoCAD	Autodesk.	Versione Educational	stesura
Supplemento B-27	Gibco	Codice 12587-010	Integratore di B-27 (50x), meno vitamina A
Fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF)	Peprotech	AF-100-18B	Chiamato anche FGF-basico umano ricombinante
Tappo di gomma nera	TERUMO	DVR-3413	Da 3 mL di siringhe per somministrazione orale, senza ago
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	B4287	Reagente bloccante
centrifuga	HSIANGTAI	CV2060	centrifuga
Tracciatore laser CO2	Strumenti laser e Technics Corp.	ILS-II	Acquistato da http://www.lttcorp.com/index.htm
Connettore conico	IDEX Salute e Scienza	F-120X	Singolo pezzo a tenuta di dita 10-32 conico, per 1/16" OD naturale
Adattatore cono-Luer	IDEX Salute e Scienza	P-659	Adattatore Luer 10-32 da femmina a femmina Luer, PEEK
Microscopio a fluorescenza confocale	Leica Microsystems	TCS SP5	Manuale utente Leica TCS SP5, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
macchina fotografica digitale	Olimpo	E-330	Acquisizione automatica delle immagini in time-lapse
Oscilloscopio digitale	Tektronix	TDS2024	Misura i segnali di tensione o corrente nel tempo in un circuito o componente elettronico per visualizzare ampiezza e frequenza.
Nastro biadesivo	3M	ANIMALE DOMESTICO 8018	Acquistato da http://en.thd.com.tw/
Miscela di nutrienti F-12 modificata di Dulbecco Eagle's medium/Ham's (DMEM/F12)	Gibco	12400024	DMEM/F-12, polvere, HEPES
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Gibco	21600010	DPBS, polvere, senza calcio, senza magnesio
Multiplexer EF	Fornitore verificato - Asiatic Sky Co., Ltd.	Personalizzato	Monitorare e controllare la corrente elettrica nei singoli canali
Fattore di crescita epidermico (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Chiamato anche EGF umano ricombinante
Colla cianoacrilica ad azione rapida	3M	7004T	Forza adesiva istantanea (liquida)
Connettore a fondo piatto	IDEX Salute e Scienza	P-206	Dado maschio senza flangia Delrin, 1/4-28 fondo piatto, per 1/16" OD blu
Generatore di funzioni	Tecnologie Agilent	33120A	Generatore di funzioni sintetizzate a 15 MHz ad alte prestazioni con capacità di forma d'onda arbitraria integrata
Vetro all'ossido di indio-stagno (ITO)	Merck	300739	Per riscaldatore ITO
Termocoppia di tipo K	Tecpel	TPK-02A	Termocoppie di temperatura
Adattatore Luer	IDEX Salute e Scienza	P618-01	Adattatore Luer femmina Luer a 1/4-28 maschio polipropilene
Siringa Luer lock	TERUMO	DVR-3413	Per ponti salini in agar
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Vita di base	BL2651	Soluzione di lavaggio
Poli-L-lisina (PLL)	sigma	P4707	Soluzione di rivestimento
Occhiali di copertura di precisione spessore n. 1,5 H	MARIENFELD	107242	https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Stadio motorizzato X-Y-Z programmabile	Tanlian Inc	Personalizzato	Acquistato da http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Controllore proporzionale-integrale-derivativo (PID)	Toho Elettronica	TTM-J4-R-AB	Regolatore di temperatura
Tubo in PTFE	Professional Plastics Inc. Filiale di Taiwan	Diametro esterno 1/16 pollici	Tubo in PTFE traslucido bianco
Pompa a siringa	Sistemi della Nuova Era Inc	NE-1000	Pompa a siringa singola programmabile NE-1000
Detergente TFD4	FRANKLAB	TFD4	Detergente per vetri di copertura
Incollatore termico	Kuan-MIN Tech Co.	Personalizzato	Acquistato da http://kmtco.com.tw/
Ultrasuoni	Leone	LEO-300S	Pulitore ad ultrasuoni per steri-cleaner
Camera a vuoto	DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.	DOV-30	Forno di essiccazione sottovuoto
Tappo bianco a tenuta di dita	IDEX Salute e Scienza	P-316	1/4-28 fondo piatto, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html