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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
La Figura 1 illustra una panoramica schematica del flusso di lavoro di questo protocollo.
1. Riprogrammazione e manutenzione dell'iPSC
- Raccogliere 8 ml di sangue del soggetto (paziente anziano o malato; di età pari o superiore a 65 anni) in provette per la preparazione delle cellule (CPT) con citrato di sodio o in acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) o provette eparinizzate.
- Centrifugare a 1.800 x g per 30 minuti a temperatura ambiente (RT) per raccogliere il pellet contenente solo sangue periferico e nessun siero.
- Utilizzare vettori di riprogrammazione specializzati secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali) per ottenere iPSC.
- IPSC di coltura in piastre di coltura a 6 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale a fattore di crescita ridotto senza feeder, prive di lattosio deidrogenasi (LDEV) in terreni essenziali 8 (E8) (vedere la Tabella dei materiali) a 37 °C in atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
- Mantenere le iPSC nei terreni E8 per 3-4 giorni al fine di evitare il sovraffollamento o la differenziazione spontanea.
- Convalidare la pluripotenza delle linee iPSC utilizzando marcatori immunofluorescenti (fase 2) e testare il micoplasma (fase 3).
2. Colorazione della pluripotenza
- Per conservare le soluzioni e gli anticorpi, seminare le cellule su piastre di coltura rivestite (fase 1.4) a 24 pozzetti 3-4 giorni prima dell'analisi. Aspirare il terreno con una pipetta e fissare le cellule con formaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS) per 15-20 minuti a RT.
- Lavare le cellule 3 volte con 1 PBS e permeabilizzare con Triton-X 100 allo 0,1% in albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS per almeno 15 minuti, ma non più di 1 ora a RT.
- Lavare 3 volte con 1 PBS e bloccare con il 5% di BSA in PBS per 30 minuti a RT.
- Lavare nuovamente 3 volte con 1 PBS e aggiungere gli anticorpi Sox2 e Oct3/4 (diluizione 1:100; vedi Tabella dei materiali) e la colorazione nucleica DAPI in BSA all'1% (diluizione 1:4.000) per una notte a 4 °C. Avvolgere in un foglio di alluminio per proteggere dalla luce.
- Lavare 3 volte con 1 PBS e lasciare le celle in PBS. Immagine con un microscopio a fluorescenza con un ingrandimento 10-20x. Assicurarsi che i marcatori di pluripotenza che determinano il sesso nella regione Y-box 2 (Sox2) e il fattore di trascrizione legante l'ottamero 3/4 (Oct3/4) siano localizzati nei nuclei delle cellule.
3. Test del micoplasma
NOTA: Fare riferimento al protocollo del kit di rilevamento (vedere la Tabella dei materiali) per l'esecuzione dettagliata del saggio e le fasi di analisi. Il kit di rilevamento fornisce il reagente, il substrato e il tampone del saggio per l'analisi del micoplasma.
- Prima di passare le cellule o rinfrescare il terreno, raccogliere 2-3 mL di terreno di coltura cellulare in una provetta da centrifuga e pellettare eventuali cellule o detriti a 200 x g per 5 minuti a RT. Conservare il surnatante a 4 °C per ≤5 giorni. Incubare le cellule con il terreno per almeno 24 ore per garantire un segnale rilevabile.
- Aggiungere 100 μl di surnatante cellulare a una provetta nuova o a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con pareti bianche (si consiglia un fondo opaco, vedere la Tabella dei materiali). Ricostituire il reagente e il substrato nel tampone del saggio ed equilibrare per 15 minuti a RT.
- Aggiungere 100 μl di reagente al campione e incubare per 5 minuti a RT. Misurare la luminescenza con un luminometro (misura #1).
- Aggiungere 100 μl di substrato al campione e incubare per 10 minuti a RT. Misurare la luminescenza (misura #2).
- Determinare la contaminazione da micoplasma in base al rapporto tra la misura #2 e #1. Fare riferimento al manuale del kit per l'interpretazione dei risultati.
4. Preparazione del microfilamento
- Iniziare la preparazione dei microfilamenti di poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA, vedi Tabella dei materiali) sfilacciando il filo di sutura con l'estremità smussata di un bisturi. Spruzzare leggermente la fibra sfilacciata con etanolo al 70%.
- Al microscopio e utilizzando un righello, iniziare a tagliare la fibra PLGA in frammenti di 500 μm a 1 mm di lunghezza. Tagliare circa 25 mm di fibra in totale. Conservare i filamenti in una provetta da 15 mL con una soluzione antibiotico-antimicotica da 1 mL.
- Nella cappa, diluire la soluzione di fibre con 10 mL di DMEM/F-12 (Tabella 1). Agitare bene per mescolare la soluzione.
nota: Lavorare in una cappa a flusso per colture cellulari in un ambiente sterile.
- Aggiungere 20 μl della soluzione di fibre a tre corpi embrioidi (EB) formando pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. In microscopia a campo chiaro, contare e calcolare la media delle fibre per pozzetto. Diluire o concentrare in media 5-10 microfilamenti di PLGA per pozzetto. Prepara bene ogni pozzo in questo modo.
- I pozzetti sono ora pronti per essere seminati con le cellule. Conservare la piastra a temperatura ambiente fino al momento del bisogno o a 4 °C per il giorno successivo.
5. Formazione del corpo embrioide (EB)
NOTA: Tutti i media e le soluzioni devono essere riscaldati a RT.
- Una volta che le iPSC hanno raggiunto la confluenza del 70%-80% (Figura 2A), sono pronte per essere fatte passare e utilizzate per la formazione di EB. Controllare le cellule con un microscopio con un ingrandimento 10x-20x. Assicurarsi che le colonie mostrino aree minime (<10%) di differenziazione spontanea.
- Aspirare il terreno con una pipetta e lavare le cellule una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbecco. Dissociare le colonie aggiungendo 500 μL di soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) o 0,5 mM di EDTA e incubare per 3-5 minuti a 37 °C.
nota: Lavorare in una cappa a flusso per colture cellulari in un ambiente sterile.
- Raccogliere le cellule rilasciate aggiungendo 1 mL di terreno E8 fresco a ciascun pozzetto e pipettare delicatamente fino a quando tutte le cellule non si sono staccate.
- Trasferire 1,5 mL di sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e aggiungere un altro 1 mL di terreno E8 fresco per raggiungere un volume totale di 2,5 mL.
- Centrifugare a 290 x g per 3 min a RT.
- Aspirare il surnatante con una pipetta, risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno Essential 6 (E6, vedere Tabella dei materiali) integrato con 50 μM di inibitore della proteina chinasi associata a Rho (ROCK) e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
- Preparare una sospensione cellulare di 60.000-90.000 cellule/mL, a seconda della densità di semina desiderata, in terreno E6 integrato con 50 μM di inibitore ROCK (vedere la Tabella dei materiali).
- Aggiungere 150 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con attacco ultra-basso (ULA) (o una piastra concava preparata). Semina 9.000-11.000 cellule per pozzetto.
- Centrifugare la piastra per forzare l'aggregazione delle celle a 290 x g per 1 minuto a RT. Porre la piastra nell'incubatore a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2.
6. Induzione neuroepiteliale
- Dopo 24 ore, aspirare con cautela 120 μl di terreno con una pipetta. Assicurarsi di non aspirare l'EB abbassando troppo il puntale della pipetta nel pozzetto.
- Aggiungere 150 μL di terreno E6 (a RT) integrati con 2 μM di XAV939 e il soppressore delle madri contro gli inibitori decapentaplegici (SMAD): 10 μM di SB431542 e 500 nM di LDN 193189 per pozzetto (vedere la Tabella dei materiali).
- Cambia il terreno ogni giorno con terreni E6 appena preparati integrati con 2 μM di XAV939, 10 μM di SB431542 e 500 nM di LDN 193189,
nota: Entro il giorno 6 (DIV6), gli EB dovrebbero avere un diametro di 550-600 μm ed essere pronti per un'ulteriore differenziazione.
7. Differenziazione e maturazione degli organoidi
NOTA: Tutti i media devono essere riscaldati a RT.
- A circa DIV7, verificare se tutti gli EB hanno raggiunto un diametro di 550-600 μm e mostrano un bordo liscio e chiaro (Figura 2B); a questo punto, sono pronti per essere incorporati in una matrice extracellulare (ECM).
nota: Lavora in un ambiente sterile.
- Preparare i fogli di inclusione con fossette dalla pellicola sigillante termoplastica (vedere la Tabella dei materiali) posizionando un foglio di pellicola (lungo circa 4 pollici) su una scatola P200 vuota. Utilizzando una provetta conica da 15 ml o una provetta per microcentrifuga da 500 μl, premere delicatamente il foglio di pellicola nei fori per formare 12 fossette. Spruzzare il foglio di pellicola con etanolo al 70% e lasciarlo asciugare all'interno della cappa a flusso con la luce UV accesa per almeno 30 minuti.
- Scongelare una quantità sufficiente di matrice della membrana basale (Matrigel, vedi Tabella dei Materiali) sul ghiaccio e posizionarla all'interno della cappa di flusso.
nota: Per EB, sono necessari circa 30 μl di matrice di membrana non diluita. Mantenere sempre la matrice della membrana al di sotto di 4 °C per evitare che si gelifichi. Si consigliano anche puntali per pipette pre-raffreddati in quanto rallentano la polimerizzazione della matrice nel puntale durante il pipettaggio, riducendo così la perdita di materiale.
- Utilizzando un puntale P200 a foro largo, trasferire un EB su ciascuna fossetta e rimuovere la maggior quantità possibile di terreno con un normale puntale per pipetta. Fai attenzione a non lasciare che gli EB si asciughino. Utilizzando un normale puntale P200, aggiungere ~30 μL di matrice di membrana non diluita a ciascun organoide, assicurandosi che l'EB sia al centro della gocciolina.
- Una volta che tutti gli EB sono incorporati nella matrice, posizionare il foglio di pellicola contenente gli EB in una capsula di Petri sterile.
nota: Opzionalmente, una piccola capsula di Petri riempita con acqua sterile può essere collocata nella capsula di Petri più grande accanto al foglio di pellicola per evitare l'evaporazione.
- Trasferire la capsula in un'incubatrice e incubare a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 per circa 10 minuti per far solidificare la matrice di membrana.
- Per ogni set di 12 organoidi incorporati, preparare 5 mL di terreno di differenziazione con B27 senza vitamina A (Tabella 1) in un pozzetto di una piastra ULA a 6 pozzetti. Preriscaldare la piastra a 37 °C in un'incubatrice.
- Una volta terminato il tempo di incubazione, trasferire gli EB incorporati nella piastra a 6 pozzetti ULA prendendo il foglio di pellicola e spingendo fuori le fossette dal retro del foglio. Se necessario, prelevare 1 mL dal pozzetto e pipettarlo sul foglio per aiutare le goccioline a staccarsi dalla pellicola.
nota: Importanti cambiamenti morfologici possono essere osservati 1 giorno dopo l'inclusione; Gli EB passano dall'avere bordi lisci a sporgenze sporgenti che formano gemme (Figura 2C).
- Dopo 2 giorni (DIV9), eseguire un cambio di mezzo supporto. Fare attenzione a non aspirare o danneggiare le goccioline della matrice di membrana durante il processo.
- Dopo altri 2 giorni (DIV11), eseguire un cambio completo del fluido, integrando il fluido con 3 μM di CHIR99021 (vedere la tabella dei materiali).
- A DIV14, cambiare il terreno in terreno di differenziazione con B27 con vitamina A (Tabella 1) per un aumento graduale delle dimensioni degli organoidi.
- Al DIV16, posizionare la piastra del pozzetto su un agitatore orbitale a 90 giri/min all'interno di un'incubatrice. Cambia il supporto ogni 2 giorni.
- Ogni 40 DIV, diluire 500 μL della matrice di membrana per ogni 50 mL di terreno per ulteriori nutrienti nel terreno.
Tabella 1: Composizione dei mezzi di differenziazione utilizzati nel presente studio.
| Reagente | Concentrazione finale | Volume (50 mL totali) |
| DMEM-F12 | 50% | 25 ml |
| Terreno neurobasale | 50% | 25 ml |
| Supplemento N2 (100x) | 1x | 0,25 ml |
| Integratore B27 -/+ Vitamina A (50x) | 0,5 volte | 0,5 ml |
| insulina | 0,25% | 12,5 μl |
| GlutaMAX (100x) | 1x | 0,5 ml |
| MEM-NEAA (100x) | 0,5 volte | 0,25 ml |
| HEPES (1 M) | 10 mM | 0,5 ml |
| Antibiotico/Antimicotico (100x) | 1x | 0,5 ml |
| 2-β-mercaptoetanolo | 50 μM | 17,5 μl |
| NOTA: alcuni DMEM-F12 contengono già GlutaMAX, non c'è bisogno di aggiungerne altri. |
