Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
Tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate in questo protocollo sono elencati nella Tabella dei Materiali e devono essere utilizzati sterili. Il supporto deve essere riscaldato a temperatura ambiente (RT) prima dell'uso, se non diversamente specificato. Per una panoramica del protocollo di co-coltura, vedere la Figura 1.
1. Differenziazione dei progenitori dei motoneuroni dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
- Seguire il protocollo di differenziazione dei motoneuroni, adattato da uno studio precedente, fino a raggiungere lo stato di progenitori neurali (NPC) del giorno 10. Secondo il periodo di tempo del protocollo, la differenziazione viene avviata il lunedì (giorno 0), il che si traduce in NPC del giorno 10 il giovedì.
- Cryopreserve giorno 10 NPC in sostituzione del siero knock-out con dimetilsolfossido (DMSO) al 10% a una densità di 2 x 106- 4 x 106 cellule per fiala.
cautela: Il DMSO è tossico: maneggiare in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale.
NOTA: Circa il 50% dei 10 NPC del giorno dovrebbe essere vitale dopo lo scongelamento. Interrompere il protocollo di differenziazione del motoneurone a questo stato di "NPC del giorno 10" e crioconservare gli NPC per generare un gran numero di NPC, che possono essere conservati e utilizzati in seguito, riducendo la durata complessiva del protocollo di co-coltura da 28 giorni a 19 giorni totali.
2. Derivazione e mantenimento dei mesoangioblasti umani (MAB)
NOTA: I MAB sono cellule staminali mesenchimali associate ai vasi, che in questo caso sono state raccolte da biopsie ottenute da un donatore sano di 58 anni. Sono disponibili fonti commerciali alternative. Viene brevemente spiegato il protocollo per ottenere i MAB. Per ulteriori informazioni, fare riferimento al protocollo dettagliato. Tutti i mezzi MAB devono essere riscaldati a 37 °C prima dell'uso.
- Tritare il tessuto bioptico e incubare su piastre di 6 cm rivestite di collagene (da pelle di vitello) in un terreno di crescita (Tabella 1) per 2 settimane. Cambiare il mezzo ogni 4 giorni.
- Per preparare il rivestimento di collagene, sciogliere 100 mg di collagene in 20 ml di acido acetico 0,1 M. Il collagene impiega tempo per dissolversi, quindi posiziona la miscela su una piattaforma a dondolo durante la notte a RT. Il giorno seguente, rabboccare con 80 mL di ddH2O fino a un volume finale di 100 mL.
cautela: L'acido acetico è tossico; maniglia in cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale.
nota: Il collagene del rivestimento in pelle di vitello può essere riutilizzato fino a 5 volte. Conservare a 4 °C.
- Rivestire l'intera superficie del piatto o del pallone con collagene, chiudere e incubare per 20 minuti a RT all'interno di un flusso laminare. Dopo 20 minuti, recuperare il collagene in un contenitore fresco, chiudere la piastra/pallone vuoto e lasciare agire per 10 minuti a RT nel flusso laminare.
- Trasferire la piastra/pallone nell'incubatore per l'incubazione notturna (o almeno 6 ore) (37 °C, 5% CO2). Lavare 5 volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco senza calcio o magnesio (DPBS) prima di galvanizzare le celle.
- Dopo 14 giorni, i FACS (fluorescent activated cell sorting) selezionano i MAB per la fosfatasi alcalina umana seguita da un'ulteriore espansione. Mantenere i MAB sui palloni T75 rivestiti di collagene nel terreno di coltura e cambiare il terreno di crescita ogni 2 giorni (10 ml per matraccia).
- Crioconservazione, passaggio o MAB seme nei dispositivi quando si raggiunge il 70% di confluenza.
nota: I MAB perdono il loro potenziale miogenico a causa di fusioni spontanee al contatto cellula-cellula. Assicurarsi di non superare il 70% di confluenza quando si espandono i MAB. Un pallone di T75 confluente al 70% contiene circa 600.000-800.000 cellule, che possono essere crioconservate a 100.000 cellule per fiala. Ogni fiala può essere successivamente scongelata e seminata in una fiaschetta T75 per l'espansione.
- Per passare i MAB, lavarli delicatamente una volta con 7 mL di DPBS e poi incubarli in 7 mL di soluzione di dissociazione MAB per 3 minuti a 37 °C in CO2 al 5% per dissociare le cellule.
- Neutralizzare la soluzione di dissociazione MAB con 7 mL di terreno di coltura, raschiare delicatamente le cellule e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 50 mL. Lavare delicatamente il pallone con altri 5 ml di terreno di coltura per raccogliere i MAB potenzialmente rimanenti.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 300 x g, quindi passare direttamente a un nuovo pallone T75 rivestito di collagene per l'espansione, crioconservare in sostituzione del siero knock-out con DMSO al 10% o contare per seminare in un dispositivo microfluidico.
NOTA: I passaggi vengono eseguiti 1x-2x a settimana per l'espansione delle celle fino a un numero massimo di passaggi di 13. Dopo la dissociazione, i MAB appaiono sferici e di grande forma quando esaminati al microscopio.
3. Preparazione di dispositivi microfluidici preassemblati - Giorno 9
NOTA: Il protocollo è adattato dal protocollo del dispositivo neuronale del produttore del dispositivo microfluidico ed è stato regolato per l'uso sia di dispositivi preassemblati che in silicone. Qui, i dispositivi preassemblati vengono utilizzati per l'immunocitochimica (ICC) e le registrazioni transitorie di calcio su cellule vive, mentre i dispositivi in silicone vengono utilizzati per la microscopia elettronica a scansione (SEM). La sequenza temporale del protocollo segue la sequenza temporale per il protocollo di differenziazione dei motoneuroni.
- Preparare i dispositivi microfluidici il giorno prima della semina delle cellule, poiché il rivestimento deve incubare durante la notte. Secondo il protocollo del motoneurone, questo sarà un mercoledì. Aggiungere ~10 ml di etanolo al 70%-100% in una piastra di Petri da 10 cm. Utilizzare una pinza per trasferire il dispositivo dal contenitore di spedizione alla capsula di Petri per la sterilizzazione.
- Immergere il dispositivo in etanolo per 10 s e trasferire il dispositivo con una pinza su un pezzo di carta per asciugarlo all'aria nel flusso laminare per ~30 minuti. Capovolgere il dispositivo alcune volte per consentire a entrambi i lati di asciugarsi. Quando il dispositivo è asciutto, utilizzare una pinza per spostare ciascun dispositivo in una singola capsula di Petri da 10 cm per una facile manipolazione.
cautela: L'etanolo è tossico; maniglia in una cappa aspirante con dispositivi di protezione individuale
- Rivestire il dispositivo con poli-L-ornitina (PLO) (100 μg/mL) in DPBS e incubare a 37 °C, 5% CO2 per 3 ore.
- Utilizzare una pipetta P200 per aggiungere 100 μl di PLO in DPBS in un pozzetto superiore il più vicino possibile all'apertura del canale e osservare il fluido che passa dal pozzetto superiore attraverso il canale al pozzetto inferiore. Successivamente, aggiungere 100 μL di PLO in DPBS sul pozzetto inferiore.
- Ripetere l'operazione sull'altro lato delle microscanalature e terminare aggiungendo 100 μl su un lato del dispositivo per creare un gradiente di volume tra i due lati speculari del dispositivo per rivestire le microscanalature (ad esempio, lato destro 200 μl, lato sinistro 300 μl). Dopo 3 ore, lavare il dispositivo 3 volte per 5 minuti con DPBS. Se necessario, utilizzare un sistema di aspirazione.
nota: Assicurarsi di evitare la formazione di bolle d'aria nei canali in qualsiasi momento durante il rivestimento o la coltura delle cellule. Anche le bolle più piccole si espandono in breve tempo, inibendo così il rivestimento, la semina delle cellule o il flusso di terreno attraverso il canale. Se il fluido si ferma nel canale durante il rivestimento, risospendere la soluzione di PLO direttamente nel canale da entrambi i lati. Se sono ancora presenti bolle, utilizzare 200 μl di DPBS per lavare il canale e ripetere il processo di rivestimento come indicato sopra nei passaggi 3.3.1-3.3.2. Se compaiono bolle dopo l'inseminazione delle cellule, è impossibile recuperare il dispositivo, poiché il lavaggio del canale danneggerà le cellule.
- Rivestire il dispositivo con laminina (20 μg/mL) in un terreno neurobasale e incubare per una notte a 37 °C, 5% CO2. Segui le stesse istruzioni per il rivestimento PLO dei passaggi 3.3.1-3.3.2.
- Il giorno seguente, utilizzare una pipetta P200 e posizionare il puntale nel pozzetto opposto all'apertura del canale per rimuovere il rivestimento di laminina dai pozzetti. Aggiungere DPBS a tutti i pozzetti e lasciare i dispositivi con DPBS nel flusso laminare a RT per la semina cellulare.
NOTA: Da questo momento in poi, è importante non rimuovere il liquido (rivestimento di laminina, DPBS, fluidi, soluzione di fissaggio, ecc.) direttamente dai canali, poiché ciò potrebbe causare la formazione di bolle d'aria. Ispezionare sempre i dispositivi al microscopio prima di seminare le cellule.
4. Placcatura di NPC in dispositivi microfluidici - Giorno 10
NOTA: Secondo il protocollo di differenziazione dei motoneuroni, la placcatura degli NPC del giorno 10 avviene di giovedì.
- Utilizzare NPC del giorno 10 appena dissociati o scongelare 1-2 fiale di NPC conservate per 10 mL di terreno del motoneurone del giorno 10 (Tabella 2 e Tabella 3) con una soluzione di inibitore ROCK (10 μL/mL) e centrifugare la sospensione cellulare a 100 x g per 4 minuti.
- Risospendere il pellet cellulare in 500-1000 μL di terreno motoneuronale al giorno 10 con soluzione di inibitore ROCK (10 μL/mL) e contare le cellule vive utilizzando qualsiasi metodo di conteggio preferito.
nota: Come indicato di seguito, assicurati di risospendere gli NPC nella quantità corretta di terreno per accogliere un volume di semina ottimale.
- Rimuovere il DPBS da due pozzetti su un lato delle microscanalature del dispositivo con una pipetta P200 e seminare 250.000 NPC per dispositivo in 60-100 μL di terreno per motoneuroni al giorno 10.
- Nel pozzetto in alto a destra, seminare 30-50 μl della sospensione cellulare (125.000 cellule) vicino all'apertura del canale con un angolo di 45° e trascinare delicatamente il fluido rimanente lungo il fondo del pozzetto verso il centro del pozzetto con la punta della pipetta.
- Mettere in pausa per alcuni secondi per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di ripetere l'operazione nel pozzetto inferiore (125.000 cellule in 30-50 μL). Usa una penna per contrassegnare il lato seminato "NPC" o equivalente per un facile orientamento del dispositivo senza microscopio.
- Incubare il dispositivo a 37 °C, 5% CO2 per 5 minuti per consentire l'adesione delle cellule prima di rabboccare i pozzetti a due semi con un ulteriore terreno di motoneurone del giorno 10 (totale 200 μL/pozzetto) e incubare nuovamente a 37 °C, 5% CO2,
nota: Ogni pozzetto può contenere 200 μl. La semina delle cellule sia nei pozzetti che nei canali garantisce una struttura robusta della coltura, riducendo il rischio di distacco delle cellule durante i cambi di terreno. È possibile seminare meno cellule solo nel canale. Tuttavia, ciò renderà la coltura più suscettibile alla corrente di volume attraverso i canali durante ogni cambio di fluido.
- Utilizzare una pipetta P200 per rimuovere il DPBS dai due pozzetti sull'altro lato delle microscanalature opposte agli NPC appena seminati. Aggiungere 200 μL/pozzetto di terreno di coltura del motoneurone del giorno 10 e attendere alcuni secondi tra il pozzetto superiore e quello inferiore per consentire al terreno di fluire attraverso il canale. Quindi, aggiungere 6 ml di DPBS per piastra da 10 cm intorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del terreno durante l'incubazione.
nota: Se necessario, aggiungere altri DPBS intorno al dispositivo durante il periodo di coltura .
- Eseguire un cambio completo del mezzo del motoneurone in entrambi i compartimenti del dispositivo il giorno 11 (venerdì), il giorno 14 (lunedì) e il giorno 16 (mercoledì) (Tabella 2 e Tabella 3). Aggiungere nuovi supplementi di terreno il giorno del cambio del mezzo.
nota: Da questo punto in poi, eseguire tutte le sostituzioni del fluido con una pipetta P200. Posizionare sempre il puntale della pipetta lontano dal canale sul bordo del pozzetto e non rimuovere il liquido direttamente dal canale. Fare attenzione a non staccare i dispositivi in silicone. La rimozione e l'aggiunta del terreno devono essere eseguite lentamente per evitare il distacco delle cellule.
- Rimuovere con cautela tutti i terreni in entrambi i pozzetti con NPC posizionando il puntale della pipetta P200 sul bordo inferiore della parete del pozzetto di fronte all'apertura del canale. Aggiungere lentamente 50-100 μl di terreno fresco per motoneuroni al pozzetto superiore posizionando il puntale della pipetta P200 sul bordo superiore della parete del pozzetto di fronte all'apertura del canale.
- Mettere in pausa per alcuni secondi per consentire al fluido di fluire attraverso il canale prima di aggiungere 50-100 μl di terreno per motoneuroni sul pozzetto inferiore. Ripetere attentamente questo processo fino a quando entrambi i pozzetti contengono 200 μL/pozzetto. Ripeti sul lato senza celle.
5. Placcatura di MAB in dispositivi microfluidici - Giorno 17
- Circa 7 giorni prima di seminare i MAB nei dispositivi microfluidici (giorno 10 di differenziazione dei motoneuroni), scongelare i MAB e seminarli nel terreno di crescita (Tabella 1) in un pallone T75 rivestito di collagene per consentire una sufficiente espansione cellulare. Vedere la sezione 2.
- Il giorno 17 della differenziazione dei motoneuroni (giovedì), dissociare i MAB come spiegato nel passaggio 2.4, risospendere il pellet cellulare in ~500 μL di terreno di crescita e contare le cellule vive utilizzando qualsiasi metodo di conteggio preferito.
nota: Come indicato di seguito, assicurarsi di risospendere i MAB nella quantità corretta di terreno per adattarsi al volume di semina ottimale.
- Rimuovere il mezzo del motoneurone sul lato non seminato delle microscanalature nel dispositivo con una pipetta P200, lavare delicatamente con DPBS e seminare 200.000 MAB per dispositivo in 60-100 μL di terreno di crescita.
- Nel pozzetto in alto a destra, seminare 30-50 μl di sospensione cellulare (100.000 cellule) vicino all'apertura del canale con un angolo di 45° e trascinare delicatamente il fluido rimanente lungo il fondo del pozzetto verso il centro del pozzetto con la punta della pipetta. Mettere in pausa per alcuni secondi per consentire il flusso delle cellule attraverso il canale prima di ripetere nel pozzetto inferiore (100.000 cellule in 30-50 μL).
- Incubare il dispositivo a 37 °C, 5% di CO2 per 5 minuti per consentire l'adesione delle cellule prima di riempire i due pozzetti appena seminati con MAB con un terreno di crescita aggiuntivo (totale 200 μL/pozzetto). Incubare nuovamente a 37 °C, 5% CO2.
NOTA: Non è necessario alcun cambio medio il giorno 17 sul lato del motoneurone del dispositivo. Il cambio medio del giorno 17 secondo il metodo di differenziazione dei motoneuroni precedentemente pubblicato viene invece eseguito il giorno 18 (venerdì).
6. Implementazione di un gradiente volumetrico e chemiotattico per promuovere la crescita dei neuriti motoneuronali verso il compartimento MAB
- Il giorno 18, eseguire un cambio completo del mezzo sul lato del motoneurone con il mezzo del motoneurone del giorno 18 (200 μL/pozzetto). Seguire le istruzioni per le modifiche medie menzionate nei passaggi 4.5.1-4.5.2. Avviare la differenziazione MAB nel compartimento MAB del dispositivo (Tabella 2 e Tabella 4).
- Lavare accuratamente gli scomparti MAB una volta con DPBS prima di aggiungere il terreno di differenziazione MAB preriscaldato (Tabella 4) integrato con 0,01 μg/mL di agrina umana (200 μL/pozzetto).
nota: I MAB si fonderanno e formeranno miotubi multinucleati nel corso di una settimana.
- Il giorno 21, secondo il protocollo di differenziazione dei motoneuroni (lunedì), iniziare il gradiente chemiotattico e volumetrico (Tabella 2 e Tabella 3).
- Aggiungere 200 μL/pozzetto di terreno basale del motoneurone con 30 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), fattore neurotrofico derivato da linee cellulari gliali (GDNF) e fattore neurotrofico ciliare (CNTF), agrina umana (0,01 μg/mL) e laminina (20 μg/mL) al compartimento del miotubo (precedentemente definito come compartimento MAB). Aggiungere il terreno basale del motoneurone (100 μL/pozzetto) senza fattori di crescita al compartimento del motoneurone.
Tabella 1: Terreno di crescita MAB.Il medio può durare 2 settimane a 4 °C. Il bFGF viene aggiunto fresco il giorno dell'uso.
| Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale |
| IMDM | 1x | 80% |
| Siero fetale bovino | | 15% |
| Penicillina/Streptomicina | 5000 U/mL | 0,5% |
| L-glutammina | 50 volte | 1% |
| Piruvato di sodio | 100 mM | 1% |
| Aminoacidi non essenziali | 100x | 1% |
| Insulina transferrina selenio | 100x | 1% |
| bFGF (aggiunto fresco) | 50 μg/mL | 5 ng/mL |
Tabella 2: Mezzo basale del motoneurone.Il medio può durare 4 settimane a 4 °C.
| Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale |
| DMEM/F12 | | 50% |
| Terreno neurobasale | | 50% |
| Penicillina/Streptomicina | 5000 U/mL | 1% |
| L-glutammina | 50 volte | 0.5 % |
| Supplemento N-2 | 100x | 1% |
| B-27 senza vitamina A | 50 volte | 2% |
| β-mercaptoetanolo | 50 mM | 0,1% |
| acido ascorbico | 200 μM | 0,5 μM |
Tabella 3: Integratori di mezzi per motoneuroni.Gli integratori vengono aggiunti freschi il giorno dell'uso al mezzo basale del motoneurone.
| giorno | Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | scompartimento |
| Giorno 10/11 | Agonista levigato | 10 mM | 500 nM | ambedue |
| Acido retinoico | 1 mM | 0,1 μM | |
| REPARTO | 100 mM | 10 μM |
| BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Giorno 14 | REPARTO | 100 mM | 20 μM | ambedue |
| BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Giorno 16 | REPARTO | 100 mM | 20 μM | ambedue |
| BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| CNTF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Giorno 18 | BDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | Motoneurone |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL | |
| CNTF | 0,1 mg/mL | 10 ng/mL |
| Giorno 21+ | BDNF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL | Miotubo |
| GDNF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL | |
| CNTF | 0,1 mg/mL | 30 ng/mL |
| Agrin | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
| Laminina | 1 mg/mL | 20 μg/mL |
| Giorno 21+ | Nessun supplemento | | | Motoneurone |
Tabella 4: Mezzo di differenziazione MAB.Il medio può durare 2 settimane a 4 °C. L'agrina viene aggiunta fresca il giorno dell'uso.
| giorno | Reagente | Concentrazione delle scorte | Concentrazione finale | scompartimento |
| Giorno 18 | DMEM/F12 | | 97% | MAB |
| Piruvato di sodio | 100 mM | 1% |
| Siero per cavalli | | 2% |
| Agrin | 50 μg/mL | 0,01 μg/mL |
