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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Dissezione di embrioni e dissociazione di tessuto
- Alloggiare ratti femmine adulte (200-250 g) a temperatura costante (22 ± 1 °C) e umidità relativa (50%) secondo un programma regolare luce-buio (luce accesa dalle 7 alle 19) nella struttura per animali. Assicurarsi che cibo e acqua siano liberamente disponibili.
- Anestetizzare una femmina di ratto gravida dopo 18 giorni di sviluppo (E18) utilizzando isoflurano al 3%. Quindi, sacrifica l'animale mediante lussazione cervicale.
- Rimuovi gli ippocampi da ogni embrione di ratto e mettili nella soluzione salina bilanciata ghiacciata di Hank senza Ca2+ e Mg2+. Al 18° giorno di sviluppo, i tessuti dell'ippocampo e della corteccia sono molto morbidi e non hanno bisogno di essere tagliati in piccoli pezzi. Ulteriori dettagli sono disponibili all'indirizzo.
- Dissociare il tessuto in 0,125% della soluzione di tripsina/Hank contenente lo 0,05% di DNAsi per 18-20 minuti a 37 °C.
- Rimuovere la soluzione surnatante con una pipetta Pasteur e fermare la digestione enzimatica aggiungendo un terreno con il 10% di siero fetale bovino (FBS) per 5 minuti.
- Rimuovere il terreno con FBS e lavare una volta con il terreno con il suo integratore, 1% L-glutammina, gentamicina 10 μg/ml. Rimuovere nuovamente il terreno con una pipetta Pasteur e riempirlo nuovamente con una piccola quantità (500 μl) di terreno di crescita con il suo integratore, 1% L-glutammina, gentamicina 10 μg/ml.
- Dissociare meccanicamente il pellet di tessuto con una pipetta Pasteur stretta fino a quando non è evidente una sospensione lattiginosa di cellule. Non è necessario centrifugare la sospensione cellulare.
- Diluire il piccolo volume di sospensione cellulare con il terreno di coltura per ottenere un volume finale di 2,0 ml. Contare la concentrazione cellulare ottenuta con una camera emocitometrica. Diluire questa concentrazione a 1:5 per ottenere la concentrazione cellulare desiderata di 600-700 cellule/μl.
2. Placcatura delle celle
- Piastre di cellule ad una densità di circa 2.000 cellule/mm2 sull'area attiva della MEA, definita dal vincolo PDMS per creare una rete neuronale 2D.
nota: Ogni ippocampo contiene circa 5 x 105 cellule, (1 x 106 per un singolo embrione). Sezionare 6 embrioni per ottenere una quantità totale di 6 x 106 cellule in 2 ml e una concentrazione stimata di 3.000 cellule/μl. Diluire questa concentrazione a 1:5 in modo da ottenere la concentrazione cellulare desiderata e impiattare circa 600-700 cellule/μl. Se l'area MEA delimitata dal vincolo PDMS è di circa 7,065 mm2 e il numero totale di celle piatte 600 celle/μl x 24 μl = 14.400 celle, la densità finale di 2.038 celle/mm2.
- Posizionare i dispositivi MEA nell'incubatore con atmosfera di CO2 umidificata (5%) a 37 °C.
- Distribuire 160 μl di sospensione con una concentrazione cellulare di 600-700 cellule/μl (circa 100.000 cellule) sulla superficie del monostrato di microsfere posizionato all'interno delle piastre multipozzetto per completare la fase preliminare per la costruzione della coltura tridimensionale. Mettere le piastre multipozzetto nell'incubatore con atmosfera di CO2 umidificata (5%) a 37 °C.
3. 3D Costruzione di Reti Neuronali
- 6-8 ore dopo la placcatura, trasferire la sospensione (microsfere con neuroni) dalle piastre multipozzetto con molta attenzione all'interno dell'area delimitata dal vincolo PDMS utilizzando una pipetta impostata per un volume di circa 30-40 μl. Dopo ogni trasferimento, attendere circa mezzo minuto, per consentire alle microsfere di autoassemblarsi in una struttura compatta esagonale.
- Una volta che tutti gli strati sono depositati e assemblati spontaneamente, riempire con una grossa goccia di circa 300 μl di terreno la parte superiore dell'area delimitata dal vincolo PDMS.
- Mettere la struttura 3D accoppiata al MEA in incubatore (T = 37,0 °C, CO2 = 5%) per 48 ore prima di aggiungere un volume finale (circa 1 ml) di coltura con il suo supplemento.
nota: Si consideri il numero totale di perle sulle piastre multipozzetto con inserto a membrana (30.000) e il numero di perle su un singolo strato sul dispositivo MEA (6.000). La struttura 3D risultante è composta da 5 strati di microsfere e cellule. Considerando che la rete neuronale 3D non è geometricamente perfetta, la struttura 3D risultante potrebbe comprendere 5-8 strati.
- Il giorno dopo la placcatura, aggiungere con cura il volume finale del terreno (circa 900 μl) all'interno dell'anello MEA. Mantenere le colture 3D in un'atmosfera umidificata di CO2 (5%) a 37 °C per 4-5 settimane. Sostituire metà del terreno una volta alla settimana.