Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione e Coltivazione di Astrociti Cortali
NOTA: Completa questi passaggi del protocollo almeno 7 giorni prima di procedere ai passaggi successivi, poiché le colture di astrociti dovrebbero svilupparsi in monostrati confluenti prima che i neuroni vengano preparati. Gli astrociti primari derivano da colture gliali miste ottenute da cuccioli di topo intorno al giorno postnatale (P) 0-3. Devono essere utilizzati tre cervelli (6 cortecce) per pallone T75.
- Preparare il terreno per astrociti integrando il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con il 10% v/v di siero di cavallo e lo 0,1% v/v di gentamicina in condizioni sterili. Conservare il terreno a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Rivestire 3 fiasche T75 con 10 μg/mL di poli-D-lisina (PDL; in acqua per colture cellulari) per almeno 1 ora a 37 °C in presenza del 6% v/v di CO2. Dopo il rivestimento, lavare due volte i matracci con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere i cationi non legati e aggiungere 9 ml di terreno per astrociti.
- Per la preparazione del cervello, aggiungere 10 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 1 piastra di Petri da 10 cm e 1 ml di HBSS a 1 provetta da 15 ml (indipendentemente dal numero di cervelli che verranno utilizzati). Tieni a portata di mano un paio di forbici chirurgiche, 2 pinze sottili e un binocolo per la procedura.
- Decapita rapidamente 3 cuccioli con le forbici chirurgiche e raccogli le teste in un piatto vuoto di 10 cm.
- Eseguire la preparazione delle cortecce sotto il binocolo. Usando due pinze sottili, rimuovere la pelle dorsale dal cranio sulla linea mediana, partendo dal collo verso l'alto verso il livello degli occhi. Successivamente, il cervello con i suoi vasi sanguigni è visibile sotto il cranio.
- Fissare la testa all'estremità rostrale con un paio di pinze e incidere la linea mediana del cranio, iniziando dall'estremità posteriore. Successivamente, tagliare le metà destra e sinistra del cranio per esporre il cervello.
- Chiudi la punta del forcipe e posizionalo ventralmente sotto il cervello. Sollevare il cervello dal cranio e trasferirlo nella capsula di Petri da 10 cm riempita di HBSS. Procedere allo stesso modo con l'esemplare rimanente fino a quando tutti i cervelli sono raccolti nel piatto.
- Dopo aver raccolto il cervello, inizia con la separazione delle cortecce pizzicando il rombencefalo usando un paio di pinze come un paio di forbici. Eseguire un'incisione sulla linea mediana tra i due emisferi con un paio di pinze. Fissa con cura il cervello con una pinza e taglia il mesencefalo e i bulbi olfattivi usando una seconda pinza per finire con le metà corticali.
- Fissare una metà corticale con un paio di pinze e staccare le meningi dagli emisferi staccandole dal bordo laterale e successivamente estraendole dalla superficie corticale utilizzando una seconda pinza.
- Capovolgere la metà corticale con la superficie orientata verso il basso, sezionare e rimuovere con cura l'ippocampo a forma di mezzaluna utilizzando un paio di pinze. Trasferire le singole cortecce nella provetta conica da 15 ml utilizzando una pinza chiusa per trasportare una corteccia individuale.
- Dopo aver raccolto tutte le cortecce, passare alla cappa sterile a flusso laminare e iniziare con i preparativi per la dissociazione del tessuto corticale.
- Aggiungere 1 mL di DMEM a una provetta di reazione da 2 mL e aggiungere lo 0,1% p/v di papaina (30 unità). Incubare la sospensione a bagnomaria a 37 °C fino a quando non si sviluppa una soluzione chiarificata (circa 3 minuti). Aggiungere 0,24 mg/mL di L-cisteina e 20 μg/mL di DNAsi e agitare delicatamente.
NOTA: Per la digestione, è necessario circa 1 ml di soluzione enzimatica.
- Filtrare (dimensione dei pori di 0,22 μm) per ottenere 1 mL di soluzione sterile prima di aggiungerla al tessuto corticale. Incubare le provette per 30 minuti - 1 ora a 37 °C (cioè a bagnomaria).
NOTA: I passaggi da 1.11 a 1.14 sono fondamentali e devono essere completati entro 15 minuti.
- Per terminare la reazione di digestione, aggiungere 1 mL di terreno per astrociti e triturare accuratamente il tessuto digerito utilizzando una pipetta da 1 mL. Per la triturazione, muovere delicatamente lo stantuffo della pipetta, aspirando ed estrudendo così la sospensione di tessuto corticale.
- Una volta che il tessuto è stato dissociato in una sospensione unicellulare, aggiungere 5 mL di terreno per astrociti e centrifugare per 5 minuti a 216 x g.
- Aspirare con cura il surnatante dal pellet risultante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno per astrociti.
- Aggiungere le sospensioni cellulari ai flaconi T75 riempiti con 9 mL di terreno per astrociti (vedere 1.2).
- Incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore in presenza del 6% v/v di CO2. Dopo 4 giorni, eseguire il primo cambio completo del terreno (10 mL). Successivamente, cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni.
- Dopo 7 giorni, controllare se le cellule hanno formato un monostrato confluente. In caso contrario, attendere altri 2 - 3 giorni fino a quando non si raggiunge la completa confluenza della cultura.
NOTA: Gli astrociti mostrano grandi corpi cellulari appiattiti, si localizzano sul fondo del pallone e non sviluppano processi cellulari degni di nota. Differiscono dalle piccole cellule progenitrici luminose a contrasto di fase e dalla microglia che risiedono sopra il monostrato.
- Per eliminare le cellule progenitrici e ottenere una coltura di astrociti pura, posizionare le fiasche T75 su un agitatore orbitale e agitare le colture O/N a 250 giri/min. Assicurarsi che la temperatura sia regolata a 37 °C e che il filtro del pallone sia sigillato con una pellicola da laboratorio per evitare l'evaporazione del CO2.
- Il giorno successivo, aspirare il terreno e aggiungere 10 mL di terreno di coltura fresco reintegrato con 20 μM di citosina-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) per eliminare le cellule in divisione residue.
NOTA: l'incubazione con AraC per 2 - 3 giorni nell'incubatore a 37 °C, 6% di CO2 si tradurrà in una coltura di astrociti pura.
- Monitorare la purezza delle colture di astrociti mediante ispezione visiva al microscopio ottico. Se le cellule progenitrici luminose residue a contrasto di fase e la microglia risiedono ancora sopra il monostrato astrocitario (vedi passaggio 1.16), ripetere i passaggi 1.18 e 1.19.
NOTA: I monostrati di astrociti confluenti e puri possono essere mantenuti fino a 14 giorni nell'incubatore (37 °C, 6% v/v CO2) prima di procedere alla fase successiva. Cambiare metà del mezzo ogni 3 giorni. Non raccogliere, congelare e scongelare gli astrociti, poiché queste cellule perderanno le loro proprietà di supporto neuronale attraverso la procedura di conservazione.
2. Preparare gli astrociti per la cocoltura indiretta
NOTA: 48 - 72 ore prima di preparare i neuroni, trasferisci gli astrociti negli inserti di coltura cellulare. Generalmente, un singolo pallone T75 rilascia un numero sufficiente di cellule per supportare le colture neuronali ottenute con una sola preparazione.
- Posizionare tutti gli inserti necessari nelle piastre a 24 pozzetti. Rivestire ciascun inserto con 10 μg/mL di PDL (disciolto in acqua per colture cellulari) per circa 1 ora a 37 °C, 6% v/v CO2. Dopo l'incubazione, lavare gli inserti due volte con PBS. Nel frattempo procedete con la preparazione degli astrociti.
NOTA: Gli inserti riempiti con PBS possono essere conservati fino a quando la sospensione delle cellule astrocitarie non è pronta per l'uso.
- Aspirare il terreno degli astrociti (con AraC) e lavare la coltura una volta con 10 ml di PBS per assicurarsi che il siero residuo venga rimosso.
- Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA (acido etilendiamminetraacetico) allo 0,05% nei flaconi e incubare le cellule per la tripsinizzazione a 37 °C, 6% v/v CO2 per circa 10 minuti.
- Controllare il distacco delle cellule mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio e facilitare il distacco delle cellule battendo il lato dei palloni contro il desktop.
NOTA: I passaggi 2.5 - 2.8 sono fondamentali e devono essere completati entro 15 - 20 minuti.
- Dopo la tripsinizzazione, risospendere delicatamente le cellule in un terreno di coltura per astrociti da 7 mL e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL. Centrifugare per 5 min a 216 x g.
- Aspirare con cautela il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno per astrociti.
- Contare le celle utilizzando una camera di conteggio.
- Riempire il fondo dei pozzetti della piastra a 24 pozzetti con 500 μL di terreno per astrociti e trasferire 25.000 cellule in 500 μL di terreno per astrociti in ogni singolo inserto. Incubare la coltura a 37 °C, 6% v/v CO2.
NOTA: Dopo 42 - 72 ore le colture raggiungeranno circa il 100% di confluenza. In questa fase la purezza della coltura può essere verificata mediante immunocitochimica. Le colture confluenti possono essere mantenute per un massimo di 7 giorni fino a quando non si procede alla fase successiva. Cambiare metà del terreno ogni 3 giorni.
3. Preparazione dei neuroni primari dell'ippocampo
NOTA: I neuroni primari dell'ippocampo di topo dovrebbero essere derivati da embrioni E15.5 - E16 di topi gravidi a tempo.
- Preparare il terreno neuronale (MEM con 10 mM di piruvato di sodio, 0,1% p/v ovoalbumina, 2% v/v integratore di terreno B27 e 0,1% v/v gentamicina (filtrato sterile)), e il terreno di preparazione (HBSS con 0,6% p/v di glucosio e 10mM HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazina etansolfonico)). Preriscaldare e preequilibrare il mezzo neuronale in palloni filtranti a 37 °C, 6% v/v CO2.
- Posizionare i vetrini coprioggetti (diametro 12 mm) nei pozzetti delle piastre da 24 pozzetti (utilizzare gli speciali vetrini coprioggetti, che sono dentellati per l'uso con inserti per colture cellulari).
- Rivestire per almeno 1 ora con 15 μg/mL di poli-DL-ornitina in acqua (per colture cellulari) a 37 °C. Utilizzare almeno 500 μl per pozzetto per assicurarsi che i vetrini coprioggetti siano completamente coperti. Lavare i pozzetti due volte con PBS. Lasciare il PBS nei pozzetti fino alla placcatura delle cellule. Assicurarsi che i pozzetti non si asciughino.
- Per sezionare l'ippocampo, preparare 3 piatti da 10 cm riempiti con terreno di preparazione e 1 provetta da 2 ml con terreno di preparazione da 1 ml. Prepara le forbici e 2 pinze sottili.
- Sacrificare la topolina gravida per lussazione cervicale, sterilizzare l'addome lavandolo con etanolo al 70% v/v e aprire l'addome usando forbici affilate. Asportare accuratamente l'utero perlato con le forbici e trasferire l'organo in un piatto da 1 x 10 cm riempito con terreno di preparazione.
- Quindi, rimuovi gli embrioni dall'utero. Incidere con cura l'utero e rimuovere l'amnio senza danneggiare gli embrioni utilizzando 2 pinze. Successivamente, decapitare ogni embrione con un paio di forbici e trasferire le teste in un secondo piatto di 10 cm fornito con terreno di preparazione.
- Procedere con la preparazione delle teste (simile alla preparazione descritta in 1.4 - 1.7).
- Immobilizzare la testa con un paio di pinze e incidere il cranio e la pelle nella regione del collo vicino al rombencefalo, perpendicolarmente alla neuroassi. Usa un secondo paio di pinze per sollevare sia il cranio che la pelle di copertura e piega la morbida calotta cranica verso l'estremità rostrale della testa, esponendo così il cervello.
- Con l'aiuto di 2 pinze, staccare il cervello dalla cavità cranica. Per fare ciò, chiudi 1 paio di pinze e separa il cervello dal cranio partendo dai bulbi olfattivi e spostandoti verso il rombencefalo. Raccogli i cervelli in un altro piatto di 10 cm riempito con il terreno di preparazione.
- Sezionare l'ippocampo dalle parti della corteccia come descritto sopra per la preparazione degli astrociti (passaggio 1.6). Rimuovere gli ippocampi da ogni semisfera e raccoglierli nella provetta da 2 ml riempita con terreno di preparazione.
- Dopo aver completato la dissezione, trasferire il tubo sul banco sterile a flusso laminare e digerire il tessuto ippocampale con 1 ml di soluzione digestiva contenente papaina. Preparare la soluzione di digestione come descritto nei passaggi 1.9 - 1.10, ma utilizzare MEM invece di DMEM.
NOTA: I passaggi 3.9 - 3.12 sono fondamentali e devono essere completati entro 10 - 15 minuti.
- Al termine della digestione, prelevare con cautela la soluzione digestiva aspirando delicatamente con una pipetta.
- Lavare l'ippocampo 3 volte con il terreno neuronale aggiungendo in sequenza e successivamente aspirando con cura 1 ml di terreno di coltura fresco per ciclo di lavaggio. Non centrifugare la sospensione cellulare.
- Dopo l'ultima fase di lavaggio, triturare accuratamente il tessuto in 1 mL di terreno neuronale.
- Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio e piastra 35.000 cellule in terreno neuronale da 500 μL per un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (la piastra menzionata in 3.2).
NOTA: Opzionalmente, un'aliquota cellulare può essere controcolorata con blu di tripano per valutare la vitalità della preparazione cellulare. Controllare la densità di placcatura mediante ispezione visiva al microscopio (in genere 90 - 110 celle per campo visivo di un obiettivo standard 10X).
- Posizionare i neuroni nell'incubatore a 37 °C, 6% v/v CO2 per 1 ora.
- Dopo l'incubazione, estrarre dall'incubatrice gli inserti preparati (seminati con monostrati di astrociti confluenti) (vedere passaggio 2.8). Sostituire il terreno aspirando il mezzo degli astrociti e sostituendolo con 500 μl di mezzo neuronale fresco.
NOTA: Gli inserti devono ospitare monostrati di astrociti confluenti dopo 2 - 3 DIV (giorni in vitro).
- Posizionare con cura gli inserti con gli astrociti nei pozzetti che contengono le colture di neuroni (passaggio 3.13) utilizzando una pinza sterile.
- Riposizionare la co-coltura indiretta neurone-astrocita risultante nell'incubatore a 37 °C, 6% v/v CO2.
NOTA: In queste condizioni, i neuroni possono essere coltivati per un massimo di 4 settimane in un terreno completamente definito. Non è necessario alcun cambio di fluido. Per le colture di lunga durata, si consiglia di riempire i pozzetti vuoti con acqua sterile per ridurre l'evaporazione dalla piastra a 24 pozzetti.
