Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Dissezione del cervello di ratto o topo
NOTA: Possono essere utilizzati sia topi che ratti. Possono essere utilizzati anche animali di età superiore al P8 (abbiamo testato fino al P12), ma la rimozione delle meningi diventerà sempre più difficile. Inoltre, la resa e la salute delle cellule diminuiranno, poiché le cellule cerebrali degli animali più anziani avranno formato processi e connessioni intricati che potrebbero rompersi durante la dissociazione dei tessuti, portando a un aumento della morte cellulare. I preparati corticali sono descritti qui, ma possono essere utilizzate anche altre regioni del cervello.
- Porre lo 0,05% di tripsina-EDTA a bagnomaria a 37 °C.
- Eutanasia degli animali (ratti gravidi per cuccioli di E19 o animali P0-P8) aumentando lentamente la concentrazione di CO2 e isolando il cervello. I passaggi successivi richiedono una tecnica sterile.
- Se si lavora con tessuto embrionale, rimuovere prima gli embrioni dall'utero e aprire le sacche embrionali, quindi tagliare immediatamente le teste con le forbici. Quando tutte le teste sono state tagliate, trasferirle in un mezzo di dissezione pre-raffreddato.
- Una volta che le teste sono immerse nel mezzo, apri la pelle e il cranio (entrambi sono molto morbidi negli animali giovani) con una pinza e pizzica il cervelletto. Solleva con cautela il resto del cervello verso l'alto e fuori dal cranio.
nota: Da due a quattro embrioni E19 producono tessuto sufficiente per almeno otto piastre da 10 cm di astrociti corticali piastrati a 500.000 cellule per piastra il giorno della dissezione.
- Per i cuccioli appena nati o più grandi, taglia le teste con le forbici e isola il cervello tagliando medialmente la pelle in linea retta dalla parte posteriore della testa alla punta del naso. Tira da parte la pelle e taglia con cura il cranio a destra e a sinistra, quindi solleva l'osso del cranio. Taglia il cervelletto e solleva il resto del cervello dal cranio.
nota: Due o tre cuccioli di P0-P8 producono tessuto sufficiente per almeno otto piastre da 10 cm di astrociti corticali piastrati a 500.000 cellule per piastra il giorno della dissezione.
- Separare la corteccia dalla struttura sottostante del mesencefalo. Posizionare la pinza all'interno della fessura longitudinale tra gli emisferi, quindi spostare la pinza tra la corteccia e le strutture del mesencefalo di un emisfero (perpendicolare alla fessura longitudinale) per pizzicare ogni emisfero libero.
- Usando il forcipe, rimuovere tutte le meningi da ciascun emisfero (e dal suo ippocampo), quindi separare l'ippocampo. Se sono necessari astrociti ippocampali, spostare ciascun ippocampo in un tubo da 15 ml riempito con 14 ml di terreno di dissezione su ghiaccio.
- Rimuovere ulteriori aree dalla corteccia di ciascun emisfero se sono necessarie regioni specifiche (ad esempio, la corteccia frontale). Tagliare qualsiasi tessuto corticale da utilizzare per generare astrociti in pezzi non più grandi di 1 mm3. Raccogliere tutti i pezzi di tessuto corticale in una provetta separata da 15 ml riempita con un mezzo di dissezione su ghiaccio.
2. Digestione e dissociazione dei tessuti
- Una volta raccolti tutti i pezzi di tessuto, attendere che si depositino sul fondo della provetta, quindi aspirare quanto più terreno possibile.
- Aggiungere 2-3 mL di tripsina-EDTA allo 0,05% utilizzando una pipetta sierologica e incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 °C per 20 min.
nota: Rilasciare rapidamente tutta la tripsina-EDTA dalla pipetta per mescolare i pezzi di tessuto e lasciarli depositare di nuovo.
- Aspirare con cautela la tripsina-EDTA, lasciando i pezzi di tessuto nel minor liquido possibile, sul fondo della provetta.
- Aggiungere 5 mL di terreno di dissezione pre-raffreddato per lavare via la tripsina-EDTA rimanente. Pipettare a lato della parte superiore della provetta per ottenere la miscelazione dei pezzi di tessuto.
- Aspirare il mezzo di dissezione e lasciare i pezzi di tessuto nel minor liquido possibile. Ripetere questa fase di lavaggio con il terreno di dissezione pre-raffreddato altre due volte.
- Dopo l'ultima fase di lavaggio, aggiungere 1 mL di DMEM+ (riscaldato a temperatura ambiente) utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 μL e triturare il tessuto pipettandolo su e giù senza introdurre bolle.
nota: È importante evitare di produrre bolle, in quanto ciò potrebbe modificare il pH della soluzione, a cui gli astrociti sono piuttosto sensibili.
- Posizionare un filtro cellulare da 100 μm nell'apertura di una provetta da 50 ml e pre-bagnare il filtro con 4,5 ml di DMEM+ pre-raffreddato.
- Pipettare 1 mL di sospensione di tessuto dissociato sul filtro cellulare e aggiungere altri 4,5 mL di DMEM+ pre-raffreddato per lavare le cellule attraverso il filtro cellulare.
3. Celle Passanti
- Il giorno prima del passaggio, rivestire le piastre di coltura cellulare con PEI allo 0,04%.
- Il giorno in vitro (DIV) 7 dopo la dissezione, posizionare le piastre da 10 cm con le cellule in DMEM+ su un agitatore da laboratorio nell'incubatore e agitare le piastre a 110 giri/min per 6 ore.
- Lavare due volte il PEI dai vetrini coprioggetti rivestiti con acqua distillata deionizzata. Aggiungere il terreno NB+H alle piastre (500 μl per pozzetto per piastre a 24 pozzetti e 2 mL per pozzetto per piastre a 6 pozzetti). Pre-equilibrare le piastre nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 mentre le piastre da 10 cm sono in agitazione, o per almeno 30 minuti.
- 20-30 minuti prima della fine delle 6 ore di agitazione, preriscaldare 1x PBS, DMEM+, NB+H e 0,25% di tripsina-EDTA a 37 °C a bagnomaria.
- Dopo 6 ore di agitazione, togliere le piastre di coltura dall'agitatore e sostituire immediatamente il terreno (che contiene neuroni, oligodendrociti e microglia scossi dallo shaker) con 10 mL di PBS preriscaldato per piatto.
nota: È importante aspirare immediatamente il vecchio terreno contenente cellule staccate per evitare che le cellule non astrocitiche si riattacchino.
- Rimuovere il PBS e aggiungere 3 ml di tripsina-EDTA preriscaldata per piatto. Incubare ogni piastra per 4 minuti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2
- Aggiungere 5 mL di DMEM+ preriscaldato ai 3 mL di tripsina-EDTA in ciascuna piastra, pipettare le cellule dalla piastra utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL.
nota: Pipettare direttamente dal fondo del piatto: il fondo del piatto dovrebbe diventare più chiaro man mano che le cellule si staccano. Utilizzare solo terreno contenente siero (al posto di DMEM+), poiché il siero inattiva la tripsina.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 3,220 x g a 20 °C per 4 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di NB+H preriscaldato.
4. Placcatura cellulare per colture finali di astrociti
- Conta le celle.
- Piastra 20.000 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti (in 2 mL di terreno NB+H per pozzetto) o 5.000 cellule per pozzetto in piastre a 24 pozzetti (in 500 μL di terreno NB+H per pozzetto).
- Conservare le colture cellulari nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 fino a nuovo trattamento o analisi.
