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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Differenziazione di hiPSC rtTA/Ngn2-positive in neuroni su MEA a 6 pozzetti e vetrini coprioggetti
NOTA: In questo protocollo, vengono forniti i dettagli per differenziare le hiPSC rtTA/Ngn2-positive su due diversi substrati, ovvero MEA a 6 pozzetti (dispositivi composti da 6 pozzetti indipendenti con 9 microelettrodi di registrazione e 1 di riferimento incorporati per pozzetto) e vetrini coprioggetti nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. I protocolli, tuttavia, possono essere facilmente adattati per substrati più grandi (ad esempio, per i pozzetti di piastre a 12 o 6 pozzetti), scalando i valori menzionati in base all'area superficiale.
- Preparare i MEA o i vetrini coprioggetti (giorno 0 e giorno 1)
- Il giorno prima dell'inizio della differenziazione, sterilizzare i MEA secondo le raccomandazioni del produttore.
- Diluire la proteina di adesione Poli-L-Ornitina (PLO) in acqua ultrapura sterile a una concentrazione finale di 50 μg/mL. Rivestire l'area dell'elettrodo attivo dei MEA a 6 pozzetti posizionando una goccia da 100 μl di PLO diluito in ciascun pozzetto. Posizionare i vetrini coprioggetti nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti utilizzando una pinzetta sterile. Aggiungere 800 μl di PLO diluito in ciascun pozzetto. Evitare che i vetrini galleggianti vengano spinti verso il basso con il puntale della pipetta da 1000 μl.
- Incubare i MEA a 6 pozzetti e l'O/N della piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2. Il giorno successivo, aspirare l'OLP diluita. Lavare due volte le superfici in vetro dei MEA a 6 pozzetti e i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura sterile.
- Diluire la laminina in DMEM/F12 freddo a una concentrazione finale di 20 μg/mL (per i MEA a 6 pozzetti) e 10 μg/mL (per i vetrini coprioggetti). Rivestire immediatamente l'area dell'elettrodo attivo dei MEA a 6 pozzetti posizionando una goccia da 100 μl in ciascun pozzetto. Allo stesso modo, aggiungere 400 μl di laminina diluita in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti per rivestire i vetrini. Evitare che i vetrini galleggianti galleggino spingendoli verso il basso con il puntale della pipetta da 1.000 μl.
- Incubare i MEA a 6 pozzetti e la piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2 per almeno 2 ore.
- Piastra gli hiPSC (giorno 1)
NOTA: I volumi menzionati nei passaggi 3.2.1 - 3.2.4 presuppongono che le hiPSC rtTA/Ngn2-positive siano coltivate in una piastra a 6 pozzetti e che le cellule di un pozzetto siano raccolte. I volumi necessari per la placcatura delle celle sui MEA a 6 pozzetti e/o sui vetrini coprioggetti dipendono dal numero di MEA a 6 pozzetti e/o dal numero di vetrini coprioggetti utilizzati nell'esperimento; I numeri specificati nei passaggi da 3.2.6 a 3.2.8 consentono il ridimensionamento in base a diverse dimensioni dell'esperimento.
- Caldo DMEM/F12, CDS e terreno E8 con penicillina/streptomicina all'1% (v/v) in R/T. Aggiungere doxiciclina a una concentrazione finale di 4 μg/mL e inibitore ROCK al terreno E8.
- Aspirare il terreno di coltura delle hiPSC rtTA/Ngn2-positive e aggiungere 1 mL di CDS alle hiPSC. Incubare 3 - 5 minuti in un'incubatrice umidificata a 37 °C con un'atmosfera di CO2 al 5%. Controlla al microscopio se le cellule si stanno staccando l'una dall'altra.
- Aggiungere 2 mL di DMEM/F12 nel pozzetto, sospendere delicatamente le cellule con una pipetta da 1.000 μL e trasferire le cellule in una provetta da 15 mL. Aggiungere 7 mL di DMEM/F12 alla sospensione cellulare. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min.
- Aspirare il surnatante e aggiungere 2 ml del terreno E8 preparato. Dissociare le hiPSC posizionando la punta di una pipetta da 1.000 μl contro il lato della provetta da 15 mL e risospendendo delicatamente le cellule. Controllare al microscopio se le cellule sono dissociate.
- Determinare il numero di cellule (cellule/mL) utilizzando una camera emocitometrica.
nota: Un pozzetto a 6 pozzetti con confluenza dell'80 - 90% produrrà in genere 3,0 - 4,0 x 106 celle in totale.
- Aspirare la laminina diluita. Per i MEA a 6 pozzetti, diluire le cellule per ottenere una sospensione cellulare di 7,5 x 105 cellule/mL. Placcare le celle aggiungendo una goccia di 100 μl della sospensione della cella sull'area dell'elettrodo attivo in ciascun pozzetto dei MEA a 6 pozzetti. Per i vetrini, diluire le cellule fino ad ottenere una sospensione cellulare di 4,0 x 104 cellule/mL. Piastra le celle aggiungendo 500 μl della sospensione cellulare ai pozzetti della piastra a 24 pozzetti.
nota: La densità cellulare finale sui MEA è superiore a quella dei vetrini coprioggetti (Figura 1A e B). Abbiamo scoperto che questa elevata densità di celle era necessaria per registrare correttamente l'attività della rete. Nel protocollo, vengono forniti i numeri ottimali per i saggi.
- Collocare i MEA a 6 pozzetti e la piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2 per 2 ore (MEA) o O/N (piastra a 24 pozzetti).
- Dopo 2 ore, aggiungere con cautela 500 μl del terreno E8 preparato a ciascun pozzetto dei MEA a 6 pozzetti. Collocare i MEA a 6 pozzetti O/N in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera di CO2 al 5%.
- Cambia il mezzo (giorno 2)
- Il giorno successivo, preparare DMEM/F12 con l'1% (v/v) di integratore di N-2, l'1% (v/v) di aminoacidi non essenziali e l'1% (v/v) di penicillina/streptomicina. Aggiungere la neurotrofina-3 ricombinante umana (NT-3) a una concentrazione finale di 10 ng/mL, il fattore neurotrofico umano ricombinante derivato dal cervello (BDNF) a una concentrazione finale di 10 ng/mL e la doxiciclina a una concentrazione finale di 4 μg/mL. Riscaldare il fluido a 37 °C.
- Aggiungere la laminina a una concentrazione finale di 0,2 μg/mL al terreno. Filtrare il mezzo risultante. Aspirare il terreno esaurito dai pozzetti dei MEA a 6 pozzetti e dalla piastra a 24 pozzetti e sostituirlo con il terreno preparato. Incubare i MEA a 6 pozzetti e l'O/N della piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2.
- Aggiungi astrociti di ratto (giorno 3)
NOTA: I volumi menzionati in questo protocollo presuppongono che gli astrociti di ratto siano coltivati in fiasche di coltura T75. È fondamentale che gli astrociti di ratto che vengono aggiunti alle colture siano di buona qualità. Usiamo due criteri per verificare se gli astrociti di ratto sono di buona qualità. In primo luogo, la coltura di astrociti di ratto dovrebbe essere in grado di crescere confluente entro dieci giorni dall'isolamento dal cervello embrionale di ratto. In secondo luogo, dopo aver diviso la coltura degli astrociti di ratto, gli astrociti di ratto dovrebbero essere in grado di formare un monostrato confluente e tassellato (Figura 1C). Se la coltura degli astrociti di ratto non soddisfa questi due criteri, si consiglia di non utilizzare questa coltura per esperimenti di differenziazione.
- Riscaldare lo 0,05% di tripsina-EDTA in RT. Riscaldare il DPBS e il DMEM/F12 con penicillina/streptomicina all'1% (v/v) a 37 °C.
- Aspirare il mezzo esaurito della coltura degli astrociti di ratto. Lavare la coltura aggiungendo 5 ml di DPBS e agitarla delicatamente.
- Aspirare il DPBS e aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,05%. Agitare delicatamente la tripsina-EDTA. Incubare in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera di CO2 al 5% per 5 - 10 minuti.
- Controllare al microscopio se le cellule sono staccate. Stacca le ultime celle colpendo il pallone alcune volte.
- Aggiungere 5 mL di DMEM/F12 al matracciatore. Triturare delicatamente le cellule all'interno del matraccio con una pipetta da 10 mL. Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL. Centrifugare il tubo a 200 x g per 8 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di DMEM/F12. Determinare il numero di cellule (cellule/mL) utilizzando una camera emocitometrica.
- Aggiungere 7,5 x 104 astrociti per pozzetto dei MEA a 6 pozzetti. Aggiungere 2,0 x 104 astrociti per pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Incubare i MEA e l'O/N della piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera di CO2 al 5%.
- Cambia il mezzo (giorno 4)
- Preparare il terreno neurobasale con l'integratore di B-27 al 2% (v/v), L-alanil-L-glutammina all'1% (v/v) e penicillina/streptomicina all'1% (v/v). Aggiungere NT-3 a una concentrazione finale di 10 ng/mL, BDNF a una concentrazione finale di 10 ng/mL e doxiciclina a una concentrazione finale di 4 μg/mL. Inoltre, aggiungere citosina β-D-arabinofuranoside a una concentrazione di 2 μM.
NOTA: La citosina β-D-arabinofuranoside viene aggiunta al terreno per inibire la proliferazione degli astrociti e per uccidere le restanti hiPSC che non si differenziano in neuroni.
- Filtrare il terreno e scaldarlo a 37 °C. Aspirare il terreno esaurito dai pozzetti dei MEA a 6 pozzetti e dalla piastra a 24 pozzetti e sostituirlo con il terreno preparato. Mantenere i MEA a 6 pozzetti e la piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2.
- Rinfrescare il medio (giorno 6 - 28)
NOTA: A partire dal giorno 6, rinfrescare metà del terreno ogni due giorni. Dal giorno 10 in poi, il terreno viene integrato con FBS per supportare la vitalità degli astrociti.
- Preparare il terreno neurobasale con l'integratore di B-27 al 2% (v/v), L-alanil-L-glutammina all'1% (v/v) e penicillina/streptomicina all'1% (v/v). Aggiungere NT-3 a una concentrazione finale di 10 ng/mL, BDNF a una concentrazione finale di 10 ng/mL e doxiciclina a una concentrazione finale di 4 μg/mL. Dal giorno 10 in poi, integrare anche il mezzo con il 2,5% (v/v) FBS. Filtrare il substrato risultante e riscaldarlo a 37 °C.
- Rimuovere metà del terreno esaurito dai pozzetti dei MEA a 6 pozzetti e dalla piastra a 24 pozzetti utilizzando una pipetta da 1000 μl e sostituirlo con il terreno preparato. Mantenere i MEA a 6 pozzetti e la piastra a 24 pozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C con un'atmosfera del 5% di CO2.
