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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di palle neuronali come coltura di gocce sospese (Giorni in vitro (DIV) 0-3)
NOTA: Le procedure qui descritte per la preparazione della coltura della palla neuronale si basano sul metodo precedentemente riportato dal gruppo Sasaki con alcune modifiche. Abbiamo anche adottato diverse procedure del metodo del banchiere per la cultura dissociata.
- Confermare quanto segue prima di iniziare la dissezione
- Preparare tutte le soluzioni necessarie e sterilizzarle in anticipo in autoclave/filtrazione.
- Tenete pronti tutti gli strumenti e i materiali da utilizzare in ogni fase di questa coltura di neuroni corticali.
- Spruzzare e pulire la camera a flusso d'aria laminare, il tavolo di dissezione, la piastra di tavolino dello stereomicroscopio, le forbici e le pinze con etanolo al 70%.
- Eutanasia del topo dopo l'applicazione di CO2 e sezionare l'addome per ottenere embrioni E16.
- Rimuovere accuratamente il cervello dagli embrioni con l'aiuto di punte sottili di pinze e trasferirli in piastre di coltura cellulare da 60 mm contenenti 4 ml di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico, soluzione salina tamponata HEPES (HBSS).
nota: Il terreno di dissezione HBSS contiene 10 mM di HEPES (pH 7,4), 140 mM di cloruro di sodio (NaCl), 5,4 mM di cloruro di potassio (KCl), 1,09 mM di di-sodio idrogeno fosfato (Na2HPO4), 1,1 mM di potassio diidrogeno fosfato (KH2PO4), 5,6 mM di D-glucosio e 5,64 μM di fenolo rosso.
- Rimuovere il cuoio capelluto, tagliare il bulbo olfattivo, separare le cortecce da ciascun emisfero cerebrale utilizzando le punte sottili delle pinze sotto uno stereomicroscopio e trasferire in altre piastre da 60 mm contenenti HBSS fresco. Utilizzare almeno 3-5 embrioni per ogni coltura separata di sfere neuronali.
- Tagliare le cortecce in piccoli pezzi con le forbici a molla per microdissezione in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare.
- Trasferire le cortecce tritate in una provetta da 15 mL e tripsinizzare le cortecce tritate in 4 mL di tripsina allo 0,125% in HBSS per 4,5 minuti a bagnomaria a 37 °C.
nota: Questo tempo di tripsinizzazione è fondamentale per un'efficiente coltura dei neuroni, poiché l'aumento del tempo (> 4,5 minuti) porta a molti più neuroni morti.
- Trasferire gli aggregati cellulari in una nuova provetta da 15 mL contenente 10 mL di HBSS con una pipetta di trasferimento sterile e incubare a 37 °C per 5 minuti. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Trasferire gli aggregati cellulari in una nuova provetta da 15 mL contenente 2 mL di terreno neurobasale contenente GlutaMax, integratore di B27 (terreno NGB), 0,01% DNasi I e 10% siero di cavallo.
- Triturare le cortecce tripsinizzate pipettandole ripetutamente su e giù (3-5 volte) utilizzando una pipetta Pasteur in vetro fine lucidato a fuoco.
nota: Il diametro di una pipetta Pasteur in vetro fine lucidato a fuoco è molto importante, come descritto nel documento sul metodo Banker. Se la pipetta è troppo stretta per passare le cortecce, preparare pipette di 2-3 dimensioni diverse e provare con una pipetta più grande.
- Per preparare le sfere neuronali, prendere la sospensione cellulare di cui sopra e regolare la densità cellulare a 1 x 106 cellule/mL utilizzando un terreno NGB.
- Coltura dei neuroni corticali sotto forma di gocce pendenti contenenti 10.000 cellule/goccia (1 goccia è 10 μL) all'interno dei coperchi superiori di piastre di coltura da 10 cm.
- Aggiungere 7 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nella parte inferiore delle piastre di coltura, quindi conservare in un'incubatrice per 3 giorni a 37 °C con il 5% di CO2 in condizioni umidificate per consentire la formazione di sfere neuronali.