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1. Preparazione della coltura del neurone ganglio della radice dorsale adulto dissociato o del neurone DRG
- Prima di impostare la coltura, rivestire una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina e laminina. Incubare una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina allo 0,01% a 37°C per 2 ore o a 4°C durante la notte. Quindi, lavare il piatto due volte con acqua distillata.
- Incubare la piastra con una soluzione di laminina a una concentrazione di 3 μg/mL per 2 ore a temperatura ambiente, quindi lavare la piastra due volte con acqua distillata. Asciugare la piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Eutanasia di un topo in una camera di CO2 trasparente collegata a una bombola di gas CO2 compressa. Incidere la pelle sovrastante la colonna vertebrale con una lama chirurgica e sezionare bilateralmente i muscoli paravertebrali per esporre le ossa vertebrali. Rimuovere meticolosamente le ossa vertebrali utilizzando un rongeur chirurgico a punta stretta fino a quando i DRG non sono completamente esposti.
nota: I neuroni DRG adulti sono ottenuti da topi maschi adulti C57BL6 di età compresa tra 8 settimane e 12 settimane.
- Rimuovere i DRG bilateralmente dall'S1 fino al livello C1 utilizzando le forbici per iridectomia e le pinze a punta fine sotto un microscopio da dissezione. Cerca di tagliare completamente le radici dai DRG per ridurre al minimo la contaminazione delle cellule di Schwann o dei fibroblasti.
- Conservare i DRG sezionati in una piastra di Petri da 60 mm contenente 5 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) freddo su ghiaccio fino a quando tutti i DRG non sono il passaggio successivo, anche se sono ancora stati raccolti DRG rimanenti.
nota: È fondamentale sezionare i DRG il più rapidamente possibile. La raccolta di tutti i DRG da un topo non deve richiedere più di 30 minuti e 30 minuti dopo l'eutanasia, interrompere la raccolta dei DRG e procedere al trasferimento dei DRG in una provetta Eppendorf da 1,5 mL utilizzando un puntale per pipetta blu (1000 μL) con un'estremità tagliata. Rimuovere il DMEM dopo una rapida centrifuga per alcuni secondi utilizzando una mini centrifuga. Aggiungere 1 mL di DMEM contenente 125 U/mL di collagenasi di tipo XI e incubare la provetta per 90 minuti con una rotazione delicata (35-40 giri/min) utilizzando un agitatore twister in un'incubatrice a 37 °C. Immobilizzare il tubo sul pavimento dello shaker utilizzando il nastro.
- Scartare il DMEM contenente collagenasi e aggiungere 1 ml di DMEM fresco. Attendere che i DRG galleggianti affondino completamente sul fondo, quindi rimuovere il DMEM con i detriti di tessuto. Ripetere questa fase di lavaggio almeno sei volte.
nota: Non cercare di scartare completamente il surnatante. Fare attenzione a non rimuovere i DRG con il surnatante DMEM.
- Trasferire i DRG in una provetta conica da 15 mL utilizzando un puntale per pipetta blu (1000 μL) con un'estremità tagliata. Quindi pipettare delicatamente su e giù almeno 15 volte utilizzando una punta blu (1000 μl) per ottenere una sospensione cellulare omogenea. Evitare di formare bolle e cercare di non toccare il fondo del tubo conico con la punta di una pipetta.
- Centrifugare la provetta a 239 x g per 3 minuti e scartare con cura il surnatante con i detriti galleggianti. Aggiungere 1 mL di terreno neurobasale integrato con B27 (2,0% v/v) e risospendere il pellet cellulare pipettando delicatamente su e giù da 5 a 10 volte.
- Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm sovrapposto a una provetta conica da 50 mL. Attendere 2 minuti, quindi versare il terreno Neurobasal/B-27 sul colino utilizzando un pipettatore.
- Piastra tutti i neuroni DRG raccolti (circa 2 x 10neuroni DRG da un topo) su due pozzetti di piastra a 6 pozzetti. I neuroni DRG di un topo adulto coprono due pozzetti in una piastra a 6 pozzetti. Quindi posizionare la piastra in un incubatore di CO2 a 37°C fino a quando i macrofagi non co-coltivano.
2. Co-coltura di macrofagi peritoneali primari su un inserto di coltura cellulare
NOTA: Stabilire le co-colture 4 ore dopo la placcatura iniziale dei neuroni DRG dissociati
- I macrofagi peritoneali primari sono preparati da topi maschi adulti C57BL6 di età compresa tra 8 settimane e 12 settimane. Eutanasia di un animale in una camera a CO2. Incidere delicatamente la pelle addominale, esporre il peritoneo ed evitare di tagliare il peritoneo per evitare la fuoriuscita di liquido di lavaggio.
- Pungere il peritoneo utilizzando una siringa con un ago da 22 G e iniettare 10 ml di soluzione salina con tampone con fosfato ghiacciato (PBS) nella cavità peritoneale. Massaggiare delicatamente il peritoneo per 1-2 minuti. Quindi, estrarre l'ago e spremere il PBS attraverso il sito di puntura dell'ago e raccogliere il liquido di lavaggio in una provetta conica da 50 ml.
nota: Prima dell'uso, mettere la siringa sul ghiaccio per mantenere la freddezza del PBS.
- Centrifugare il liquido di lavaggio a 239 x g per 10 minuti a 4 °C per pellettare i componenti cellulari. Risospendere il pellet con 3 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) per 3 minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 239 x g per 10 minuti a 4 °C. Risospendere il pellet con 3 mL di PBS e centrifugare nuovamente la sospensione cellulare per rimuovere l'eventuale tampone di lisi dei globuli rossi rimanente.
nota: Assicurarsi che il tampone di lisi dei globuli rossi sia completamente rimosso. In caso contrario, il tampone di lisi dei globuli rossi rimanente potrebbe essere tossico per i macrofagi in coltura.
- Risospendere le cellule pellettate in 1 mL di terreno Neurobasal/B-27. Piastra metà di tutti i macrofagi raccolti (per un totale di 3 × da 106 a 6 x 106 cellule) su un inserto di coltura cellulare con un'area effettiva di 4,2 cm2, che viene posizionato sopra il pozzetto di DRG.
dissociato
nota: Durante il periodo di co-coltura, i macrofagi vengono coltivati nel terreno di coltura neuronale Neurobasal/B-27. È stata confermata un'adeguata sopravvivenza dei macrofagi in questa condizione.
3. Trattamento del db-cAMP (AMP dibutirril-ciclico) e raccolta di CM macrofago
NOTA: Inizia il trattamento con db-cAMP 4 ore dopo le co-colture neurone-macrofagi.
- Aggiungere 2 μL di soluzione di db-cAMP da 100 μM alle co-colture neurone-macrofagi. Aggiungere lo stesso volume di PBS per un esperimento di controllo.
- Dopo 24 ore, riempire un pozzetto vuoto con 1 mL di terreno di coltura per macrofagi nella stessa piastra a 6 pozzetti. Trasferire l'inserto di coltura cellulare nelle co-colture neurone-macrofagico nel pozzetto vuoto con un terreno di coltura per macrofagi. Mantenere le celle nelle stesse condizioni per 72 ore senza cambiare il mezzo.
nota: Aggiungiamo solo 1 mL di terreno di coltura macrofagico durante la raccolta del CM per ottenere un CM concentrato. Durante la raccolta di CM, se necessario, ne abbiamo aggiunti altri per coprire completamente i macrofagi all'interno dell'inserto.
- Dopo 72 ore, centrifugare il macrofago CM a 239 x g per 5 minuti per rimuovere i componenti cellulari. Far passare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 μm per rimuovere eventuali detriti cellulari rimanenti. Conservare il CM raccolto a -70 °C fino al momento dell'uso.