1. Trattamento del Db-Camp e raccolta del terreno condizionato con macrofagi
NOTA: Inizia il trattamento con db-cAMP 4 ore dopo le co-colture neurone-macrofago.
- Aggiungere 2 μL di soluzione di AMP ciclico dibutirrilico (db-cAMP) da 100 μM alle co-colture neurone-macrofagi. Aggiungere lo stesso volume di salina tamponata con fosfato (PBS) per un esperimento di controllo.
- Dopo 24 ore, riempire un pozzetto vuoto con 1 mL di terreno di coltura per macrofagi nella stessa piastra a 6 pozzetti. Trasferire l'inserto di coltura cellulare nelle co-colture neurone-macrofagico nel pozzetto vuoto con il terreno di coltura dei macrofagi. Mantenere le celle nelle stesse condizioni per 72 ore senza cambiare il mezzo.
nota: Aggiungiamo solo 1 mL di terreno di coltura macrofagico durante la raccolta del terreno condizionato (CM) per ottenere un CM concentrato. Durante la raccolta di CM, se necessario, ne abbiamo aggiunti altri per coprire completamente i macrofagi all'interno dell'inserto.
- Dopo 72 ore, centrifugare il macrofago CM a 239 x g per 5 minuti per rimuovere i componenti cellulari. Far passare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 μm per rimuovere eventuali detriti cellulari rimanenti. Conservare il CM raccolto a -70 °C fino al momento dell'uso.
2. Saggio di crescita neurite con CM raccolto
- Prima di impostare una coltura separata di neuroni DRG adulti, rivestire preventivamente un vetrino da camera a 8 pozzetti con poli-D-lisina e laminina. Incubare una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina allo 0,01% a 37°C per 2 ore o a 4°C durante la notte. Quindi, lavare il piatto due volte con acqua distillata.
- Incubare la piastra con una soluzione di laminina a una concentrazione di 3 μg/mL per 2 ore a temperatura ambiente, quindi lavare la piastra due volte con acqua distillata. Asciugare la piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Ottenere neuroni DRG adulti dissociati in terreno neurobasale integrato con B27. Piastra 5 x 104 celle per pozzetto sul vetrino della camera a 8 pozzetti pre-rivestito.
- Posizionare il vetrino della camera in un'incubatrice a 37 °C per 2 ore, in modo che le celle si attacchino al fondo. Quindi, sostituire il terreno di coltura con il CM scongelato che viene preriscaldato a 37 °C.
nota: Fare attenzione a non toccare il fondo del vetrino della camera a 8 pozzetti quando si rimuove il terreno di coltura e si aggiunge il CM raccolto.
- 15 ore dopo la prima placcatura, rimuovere il terreno e lavare le celle con PBS una volta. Quindi, aggiungere 200 μL di soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% nei pozzetti e incubare le cellule con la soluzione di paraformaldeide per 20 minuti a 4 °C
nota: La coltura dei neuroni DRG per il saggio di crescita dei neuriti deve essere limitata con precisione a 15 ore. In questa condizione, non c'è alcuna crescita apprezzabile di neuriti.
- Lavare tre volte con PBS ghiacciato e quindi eseguire il blocco con il 10% di siero normale di capra (NGS) con Triton-X allo 0,1% per 30 minuti. Incubare le cellule fissate con una soluzione di anticorpi primari (anti-Tuj-1) diluita con NGS al 10% (a una concentrazione di 1 μg/mL) per 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
- Lavare tre volte con PBS, quindi incubare le cellule con una soluzione di anticorpi secondari (capra-anti topo) per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare due volte con PBS e montare il vetrino di coltura con un vetrino coprioggetti (24 × 50 mm) utilizzando una soluzione di montaggio.
- Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza per visualizzare la crescita dei neuriti (Figura 1).
