Utilizzo di un mezzo condizionato con macrofagi per promuovere le estensioni neuronali

Abstract

Fonte: Yun, H. J., et al. Co-colture neurone-macrofago per attivare i macrofagi che secernono fattori molecolari con attività di crescita neuritaria. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra un test per promuovere la crescita delle proiezioni neuronali note come crescita neurite utilizzando il mezzo condizionato dai macrofagi. Co-coltura di neuroni e macrofagi con cAMP e raccolta del terreno condizionato derivato dai macrofagi. La crescita dei neuroni con il mezzo condizionato favorisce l'escrescenza di neuriti. Queste escrescenze vengono marcate in fluorescenza e visualizzate utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Protocollo

1. Trattamento del Db-Camp e raccolta del terreno condizionato con macrofagi

NOTA: Inizia il trattamento con db-cAMP 4 ore dopo le co-colture neurone-macrofago.

1. Aggiungere 2 μL di soluzione di AMP ciclico dibutirrilico (db-cAMP) da 100 μM alle co-colture neurone-macrofagi. Aggiungere lo stesso volume di salina tamponata con fosfato (PBS) per un esperimento di controllo.
2. Dopo 24 ore, riempire un pozzetto vuoto con 1 mL di terreno di coltura per macrofagi nella stessa piastra a 6 pozzetti. Trasferire l'inserto di coltura cellulare nelle co-colture neurone-macrofagico nel pozzetto vuoto con il terreno di coltura dei macrofagi. Mantenere le celle nelle stesse condizioni per 72 ore senza cambiare il mezzo.
   nota: Aggiungiamo solo 1 mL di terreno di coltura macrofagico durante la raccolta del terreno condizionato (CM) per ottenere un CM concentrato. Durante la raccolta di CM, se necessario, ne abbiamo aggiunti altri per coprire completamente i macrofagi all'interno dell'inserto.
3. Dopo 72 ore, centrifugare il macrofago CM a 239 x g per 5 minuti per rimuovere i componenti cellulari. Far passare il surnatante attraverso un filtro da 0,2 μm per rimuovere eventuali detriti cellulari rimanenti. Conservare il CM raccolto a -70 °C fino al momento dell'uso.

2. Saggio di crescita neurite con CM raccolto

1. Prima di impostare una coltura separata di neuroni DRG adulti, rivestire preventivamente un vetrino da camera a 8 pozzetti con poli-D-lisina e laminina. Incubare una piastra a 6 pozzetti con poli-D-lisina allo 0,01% a 37°C per 2 ore o a 4°C durante la notte. Quindi, lavare il piatto due volte con acqua distillata.
2. Incubare la piastra con una soluzione di laminina a una concentrazione di 3 μg/mL per 2 ore a temperatura ambiente, quindi lavare la piastra due volte con acqua distillata. Asciugare la piastra a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
3. Ottenere neuroni DRG adulti dissociati in terreno neurobasale integrato con B27. Piastra 5 x 10⁴ celle per pozzetto sul vetrino della camera a 8 pozzetti pre-rivestito.
4. Posizionare il vetrino della camera in un'incubatrice a 37 °C per 2 ore, in modo che le celle si attacchino al fondo. Quindi, sostituire il terreno di coltura con il CM scongelato che viene preriscaldato a 37 °C.
   nota: Fare attenzione a non toccare il fondo del vetrino della camera a 8 pozzetti quando si rimuove il terreno di coltura e si aggiunge il CM raccolto.
5. 15 ore dopo la prima placcatura, rimuovere il terreno e lavare le celle con PBS una volta. Quindi, aggiungere 200 μL di soluzione ghiacciata di paraformaldeide al 4% nei pozzetti e incubare le cellule con la soluzione di paraformaldeide per 20 minuti a 4 °C
   nota: La coltura dei neuroni DRG per il saggio di crescita dei neuriti deve essere limitata con precisione a 15 ore. In questa condizione, non c'è alcuna crescita apprezzabile di neuriti.
6. Lavare tre volte con PBS ghiacciato e quindi eseguire il blocco con il 10% di siero normale di capra (NGS) con Triton-X allo 0,1% per 30 minuti. Incubare le cellule fissate con una soluzione di anticorpi primari (anti-Tuj-1) diluita con NGS al 10% (a una concentrazione di 1 μg/mL) per 4 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
7. Lavare tre volte con PBS, quindi incubare le cellule con una soluzione di anticorpi secondari (capra-anti topo) per 2 ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare due volte con PBS e montare il vetrino di coltura con un vetrino coprioggetti (24 × 50 mm) utilizzando una soluzione di montaggio.
8. Acquisisci immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza per visualizzare la crescita dei neuriti (Figura 1).

Risultati

Figura 1: Risultati rappresentativi del saggio di crescita dei neuriti utilizzando terreno condizionato ottenuto da varie condizioni. (A, B) I neuroni DRG adulti sono stati dissociati in modo acuto e coltivati per esattamente 15 ore. 2 ore dopo la piastra, il terreno di coltura è stato sostituito con terreno condizionato (CM) ottenuto da co-colture neurone-macrofago trattate con PBS (A) o dibutirrile...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Inserto per colture cellulari membrana in PET trasparente dimensione dei pori di 0,4 μm	Corning,Falco	Codice 353090	Membrana in PET trasparente con pori di 0,4 μm, per piastra a 6 pozzetti
Filtro cellulare in nylon da 70 μm	Corning, Falco	Codice 352350
Vetrino di coltura a 8 pozzetti	Biocoat	354632	con un'applicazione uniforme di Poli-D-Lisina
Terreno neurobasale	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Codice 21103-049	Contiene l'1% di glutamax e l'1% di penicilina-streptomicina
Integratore di B-27, senza siero	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Codice 17504-044	soluzione extracellulare
Glutamax	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Codice 35050-061
Penicillina-streptomicina	Thermo Fisher Scientific, Gibco	Codice: 15140-122
Poliferamide di poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Laminina	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	Codice 23017-015
Adenosina 3', monofosfato ciclico 5', N6,O2'-dibutirril-, sale sodico	Merck Millipore Corporation, Calbiochem	Codice 28745
10% Siero di capra normale	Thermo Fisher Scientifico	16210072
Tritone-X-100	Daejung Chemical and Metal Co	8566-4405
Tubulina anti β III (Tuj-1)	Promega Corporation	G7121	Anticorpo monoclonale di topo
Anticorpo secondario anti-IgG di topo di capra (H+L)	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen	Codice: A11005
Emocitometro	Marienfeld-Superior	N/A
Incubatore a CO2 per colture cellulari	Pananica	N/A
Centrifuga da tavolo	Sorvall	N/A
Microscopio confocale	Olympus America Inc	IX71
FBS (Siero Fetale Bovino)	VWR International, Hyclone	SH30919.03