Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Camera microfluidica o preparazione MFC
- Fusione PDMS in stampi primari (Figura 1)
- Acquistare o creare stampi primari (wafer) seguendo un protocollo dettagliato.
- Utilizzare aria pressurizzata per rimuovere qualsiasi tipo di sporco dalla piattaforma del wafer prima di procedere alla fase di rivestimento. La superficie dei wafer dovrebbe apparire liscia e chiara.
- Riempire un contenitore con 50 ml di azoto liquido. Preparare una siringa da 10 ml e un ago da 23 G.
nota: Tutte le procedure da questo passo in avanti devono essere eseguite in una cappa chimica.
- Nella cappa chimica, utilizzare la siringa e l'ago per raccogliere 2 mL di azoto liquido. Anche se può sembrare che l'aria sia stata aspirata, la siringa è piena di azoto (Figura 1A). Posizionare la piastra contenente wafer in un contenitore sigillabile.
- Aprire un flacone di clorotrimetilsilano, forare il tappo di gomma utilizzando la siringa riempita di azoto e iniettare l'intero contenuto della siringa nel flacone. Senza estrarre l'ago, capovolgere il flacone e prelevare 2 mL di clorotrimetilsilano.
nota: A causa della pressione della siringa, una piccola quantità di clorotrimetilsilano viene spruzzata fuori dall'ago. Per evitare rischi, puntare l'ago verso la parete interna della cappa (Figura 1B).
- Distribuire uniformemente il clorotrimetilsilano nel contenitore (a partire dal punto 1.1.4), ma non direttamente sull'ostia o sulla piastra contenente ostia. Chiudere il contenitore e incubare per 5 minuti per wafer.
nota: Se è la prima volta che il wafer viene rivestito con clorotrimetilsilano, deve essere consentita un'incubazione di 1 ora per ciascun wafer.
- Non estrarre i wafer e il contenitore dalla cappa chimica per 30 min.
cautela: Il clorotrimetilsilano è altamente volatile.
- Pesare la base PDMS (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta da 50 ml e aggiungere l'agente indurente PDMS in un rapporto di 16:1, rispettivamente (ad esempio, 47,05 g di base e 2,95 g di agente indurente). Mescolare per 10 minuti utilizzando un rotatore a bassa velocità.
- Versare il PDMS in ciascuna piastra contenente wafer all'altezza desiderata (Figura 1C).
nota: L'utilizzo di camere microfluidiche sottili (fino a 3-4 mm) migliora l'aderenza alla piastra di coltura e previene le perdite.
- Posizionare tutte le piastre insieme all'interno di un essiccatore sottovuoto per 2 ore (Figura 1E). Questo processo rimuove l'aria intrappolata all'interno del PDMS, eliminando così le bolle d'aria e formando uno stampo chiaro e uniforme.
- Mettere le piastre all'interno di un forno per 3 ore (o tutta la notte) a 70 °C (Figura 1E).
nota: Le piastre devono essere livellate quando vengono messe in forno.
- Fusione PDMS in stampi epossidici
nota: Poiché la preparazione dei wafer è costosa, richiede attrezzature speciali e può danneggiare i fragili wafer, è possibile generare repliche epossidiche di wafer. Le repliche sono più economiche, più durevoli e possono essere utilizzate per la produzione di massa di camere microfluidiche.
- Fondere e polimerizzare il PDMS (come descritto in 1.1.8-1.1.11) nel wafer originale.
- Rimuovere e tagliare le parti in eccesso di PDMS lasciando solo gli elementi microfluidici e l'area funzionale necessaria per elaborarli in camere microfluidiche.
- Avvolgere immediatamente il PDMS con nastro spesso e appiccicoso per evitare che accumuli polvere.
- Scegliete una piastra di plastica per colture tissutali che si adatti all'intero PDMS all'interno e lasci spazio per la resina epossidica intorno ad essa. La distanza tra il PDMS e il piatto di plastica deve essere inferiore a 5 mm.
- Preparare una piccola quantità di PDMS miscelato in un rapporto di 10:1 (base: agente indurente). Il PDMS liquido fresco verrà utilizzato per incollare il PDMS solido sul fondo della piastra di plastica.
- Applicare una quantità minima di PDMS liquido sul fondo centrale della piastra di plastica, quindi rimuovere il nastro adesivo dal PDMS e farlo aderire al fondo della piastra di plastica. Assicurarsi che gli elementi microfluidici siano rivolti verso l'alto.
- Lasciare indurire il PDMS per 30 minuti in un forno a 70 °C.
- Preparare la resina epossidica mescolando la base e l'agente indurente in un rapporto di 100:45, rispettivamente in una provetta. Diverse resine epossidiche possono avere rapporti di miscelazione diversi. Il volume richiesto per una normale piastra da 100 mm è di circa 40 mL.
- Lasciare che la resina epossidica si mescoli bene per 10 minuti in un rotatore fino a quando la miscela diventa visibilmente omogenea (cioè, non ci sono artefatti visibili simili a fibre nel liquido).
- Centrifugare la miscela epossidica a 400 x g per 5 minuti per rimuovere le bolle d'aria intrappolate all'interno.
- Durante la centrifugazione, stendere un sottile strato di grasso siliconico attorno alle pareti e a tutte le altre parti in plastica esposte della piastra di coltura. Ciò impedirà alla resina epossidica di polimerizzare con la plastica della piastra e consentirà la rimozione della resina epossidica polimerizzata facilmente alla fine del protocollo.
- Versare lentamente la resina epossidica nella capsula fino a coprire completamente il PDMS e oltrepassarlo di almeno 5 mm. Prevenire la formazione di bolle all'interno della resina epossidica mantenendo una distanza zero tra il tubo e la piastra. Posizionare la piastra in un luogo sicuro in modo che non venga spostata per le successive 48 ore.
- Dopo 48 ore la resina epossidica deve essere completamente polimerizzata. Inserire la piastra in forno preriscaldato a 80 °C per 3 ore per l'indurimento finale.
- Rimuovere la resina epossidica polimerizzata dalla piastra e dallo stampo PDMS originale tirando delicatamente la parete di plastica della piastra fino a quando non si rompe. Dovrebbe quindi separarsi facilmente dalla resina epossidica e staccarsi.
- Una volta estratto, rimuovere il grasso rimanente dalla nuova replica epossidica e inserirla capovolta (cioè con gli elementi microfluidici replicati rivolti verso l'alto) in un nuovo piatto di coltura. La replica epossidica è ora pronta per la fusione PDMS.
- Utilizzare aria pressurizzata o N2 per soffiare via eventuali resti di PDMS o sporco dallo stampo epossidico e risciacquarlo 2 volte con isopropanolo. Riempirlo una terza volta e incubare per 10 minuti su una piastra di agitazione orbitale. Sciacquare nuovamente lo stampo 3 volte con isopropanolo ed eliminare il liquido rimanente. Asciugare con aria o N2 o mettere in forno a 70 °C fino a quando non si asciuga.
nota: Seguire le procedure di sicurezza quando si lavora con l'isopropanolo e lo si elimina.
- Tenere chiuse le piastre dello stampo fino alla fusione. Seguire i passaggi 1.1.8.-1.1.11.
- Punzonatura e scultura del PDMS in un MFC (Figura 2)
- Tagliare e rimuovere lo stampo PDMS dalla piastra seguendo i segni (+) sui wafer utilizzando un bisturi. Non usare la forza, poiché gli stampi sono fragili (Figura 2A).
- Seguire le istruzioni disegnate sullo schizzo per punzonare e tagliare le camere a seconda della configurazione sperimentale (Figura 2B-F).
- Per la coltura di espianto del midollo spinale (Figura 2C, E), perforare due pozzetti da 7 mm nel lato distale dell'MFC grande. Posiziona i pozzetti in modo che si sovrappongano ai bordi del canale. Sul lato prossimale, perforare un pozzetto di 7 mm al centro del canale, con una sovrapposizione minima, in modo tale da lasciare spazio sufficiente per gli espianti. Praticare due fori aggiuntivi da 1 mm nei due bordi del canale prossimale. Girare l'MFC con gli elementi microfluidici rivolti verso l'alto e, utilizzando un ago da 20 G, incidere tre piccole grotte di espianti sul pozzetto perforato da 7 mm.
- Per la coltura MN dissociata (Figura 2D, F), perforare quattro pozzetti da 6 mm nei bordi dei due canali di un piccolo MFC.
- Sterilizzazione dell'MFC per l'uso in coltura tissutale
- Stendere delle bande di nastro adesivo lunghe 50 cm sulla panca. Premere e tirare indietro la camera per affrontare il nastro adesivo (sia la faccia superiore che quella inferiore) e rimuovere lo sporco grezzo. Posizionare le camere pulite in una nuova piastra da 15 cm.
nota: Non premere direttamente sugli elementi microfluidici quando questi sono rivolti verso l'alto.
- Incubare le camere in etanolo analitico al 70% per 10 minuti su un agitatore orbitale.
- Smaltire l'etanolo e asciugare le camere in una cappa di coltura tissutale o in un forno a 70 °C.
- Posizionamento dell'MFC su un piatto con fondo di vetro
- Posizionare la camera al centro di una piastra con fondo in vetro da 35 mm/50 mm per coltura tissutale e applicare una forza minore sui bordi per far legare il PDMS e il fondo della piastra. Per evitare di rompere il fondo del vetro, applicare sempre forza sopra una superficie solida.
- Incubare per 10 minuti a 70 °C. Premere le camere per rafforzare l'aderenza alla piastra.
- Incubare sotto luce UV per 10 min.
- Rivestimento e coltura
- Aggiungere 1,5 ng/mL di poli-L-ornitina (PLO) in entrambi i compartimenti. Assicurarsi che il PLO scorra attraverso i canali pipettando il mezzo di rivestimento alcune volte direttamente all'ingresso del canale.
- Esaminare la camera microfluidica al microscopio ottico con ingrandimento 10x per verificare la presenza di bolle d'aria. Se le microscanalature sono ostruite da bolle d'aria, mettere l'MFC in un essiccatore sottovuoto per 2 minuti. Successivamente, rimuovere l'aria in eccesso che è rimasta intrappolata nei canali pipettando il mezzo di rivestimento attraverso di essi. Incubare per una notte.
- Sostituire l'OLP con la laminina (3 μg/mL in DDW) per l'incubazione notturna allo stesso modo.
- Prima della piastra, lavare la laminina con un terreno di coltura neuronale.
2. Placcatura della coltura neuronale
- Coltura di espianti del midollo spinale
- Usando forbici dritte e pinze sottili, seziona un midollo spinale da un embrione di topo E12.5 ICR-HB9:GFP. Lavorare in una soluzione 1X HBSS con penicillina-streptomicina all'1% (P/S) (Figura 3A-C).
- Utilizzando le forbici per microdissezione, rimuovere le meningi e le corna dorsali (Figura 3D).
- Tagliare il midollo spinale in sezioni trasversali spesse 1 mm (Figura 3E). Smaltire tutto il fluido dal compartimento prossimale dell'MFC.
- Prelevare un singolo espianto di midollo spinale con una pipetta in un volume totale di 4 μl. Iniettare l'espiante il più vicino possibile alla grotta ed estrarre il liquido in eccesso dal pozzetto prossimale attraverso le uscite laterali (punzoni da 1 mm). Gli espianti devono essere aspirati nel canale prossimale.
- Aggiungere lentamente 150 μL di terreno di espianto del midollo spinale (SCEX, vedere Tabella dei materiali e Tabella 3) al pozzetto prossimale.
- Mantenimento della coltura di espianti del midollo spinale
- Aggiungere il terreno SCEX nel compartimento prossimale e il terreno SCEX ricco (SCEX con 50 ng/mL di BDNF e GDNF) nel compartimento distale. Mantenere un gradiente di volume di almeno 15 μl per pozzetto tra i pozzetti distali (volume più alto) e il pozzetto prossimale.
- Rinfrescare il terreno ogni 2 giorni. Gli assoni possono impiegare fino a 3-5 giorni per attraversare distalmente.
3. Trasporto assonale (Figura 4A)
- Marcatura dei mitocondri e dei compartimenti acidi
- Preparare un terreno SCEX fresco (o CNB per MN dissociato) contenente 100 nM Mitotracker Deep Red FM e 100 nM LysoTracker Red. Incubare per 30-60 minuti a 37 °C. Altri colori possono essere utilizzati purché i loro fluorofori non si sovrappongano.
- Lavare 3 volte con mezzo caldo CNB/SCEX. Le lastre sono pronte per l'imaging.
- Imaging dal vivo
- Acquisizione di 100 serie di immagini time-lapse del trasporto assonale a intervalli di 3 s, per un totale di 5 minuti per filmato.
nota: Il sistema di imaging utilizzato in questo studio includeva un microscopio invertito dotato di disco rotante confocale, controllato tramite software di imaging cellulare proprietario, lente ad olio 60x, NA = 1,4 e una fotocamera EMCCD. I film sono stati acquisiti in un ambiente controllato a 37 °C e 5% di CO2,
nota: È possibile visualizzare filmati time-lapse più lunghi o più brevi, a seconda dell'esperimento. Se necessario, è possibile registrare anche filmati notturni. Tuttavia, è fondamentale cercare di ridurre il tempo di esposizione e la potenza del laser, nonché il numero di immagini totali, per ridurre la fototossicità e lo sbiancamento durante l'acquisizione del filmato.
