Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei materiali
- Sterilizzare tutti gli strumenti e ddH2O utilizzando un'autoclave prima di eseguire l'esperimento. Gli strumenti includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, forbici chirurgiche, forbici oftalmiche, pinze, cucchiai, divisori per nuclei, piatti di vetro (diametro 60-100 mm) e bicchieri di vetro.
- Preparare la soluzione di Krebs (Tabella 1): Sciogliere tutte le sostanze chimiche con ddH2O prima dell'uso. Sciogliere CaCI2 separatamente e aggiungerlo lentamente alla soluzione miscelata mescolando per evitare sedimenti.
- Preparare il terreno di risciacquo, che consiste in terreno F12 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotico/antimicotico (100x). Aggiungere 5 mL di FBS e 0,5 mL di antibiotico/antimicotico a 44,5 mL di terreno F12.
- Preparare il mezzo neuronale A, che comprende il terreno neurobasale A con il 2% di B-27, l'1% di FBS, l'1% di L-glutammina, l'1% di antibiotici/antimicotici (100x) e lo 0,1% di fattore neurotrofico derivato dalla glia (GDNF). Aggiungere 200 μL di B-27, 100 μL di FBS, 100 μL di L-glutammina, 100 μL di antibiotico/antimicotico (100x) e 10 μL di GDNF (10 μg/mL) a 9,5 mL di media A neurobasale.
nota: Preparare il mezzo neuronale A entro una settimana dall'uso per garantire la freschezza di B-27, L-glutammina e GDNF.
- Preparare il neurone medio B utilizzando la stessa procedura della preparazione del neurone medio A ma senza aggiungere FBS.
- Preparare la soluzione di digestione 1 sciogliendo 20 mg di collagenasi di tipo II, 6 mg di albumina sierica bovina e 200 μL di antibiotico/antimicotico (100x) in 10 mL di soluzione di Krebs stabilizzante all'ossigeno.
- Preparare la soluzione di digestione 2 diluendo 1 mL di tripsina allo 0,25% con 4 mL di soluzione salina bilanciata di Hank.
- Preparare una targa con vetrini coprioggetti rivestiti.
- Utilizzare una pinza in un banco a flusso laminare quando si posizionano vetrini coprioggetti in una piastra di coltura a 48 pozzetti.
- Diluire la poli-D-lisina con ddH2O a una concentrazione di 0,1 mg/mL come stock di poli-D-lisina. Conservare il brodo a –20 °C e scongelarlo prima
- Aggiungere 40 μL di poli-D-lisina su ciascun vetrino coprioggetti e incubare la soluzione a temperatura ambiente per 10 min.
nota: Regolare la concentrazione a 4 μg/cm2 per piastre diverse con aree basali diverse. Ad esempio, se l'area basale di un pozzetto da una piastra a 24 pozzetti è di 2 cm2, dovremmo trasferire 80 μL di stock di poli-D-lisina in un pozzetto. Ogni cm2 conterrebbe 4 μg di poli-D-lisina.
- Rimuovere la poli-D-lisina nella piastra a 48 pozzetti e sciacquare tre volte i vetrini coprioggetti con ddH2O.
- Asciugare la piastra in una cappa a flusso laminare per almeno 30 minuti per assicurarsi che la piastra sia anidra.
- Conservare la piastra a 4 °C prima del rivestimento di laminina per 1 giorno al massimo. Per la conservazione a lungo termine è preferibile conservare la lastra a -20 °C.
- Scongelare la laminina a 4 °C. Diluire la laminina con ddH2O a una concentrazione di 50 μg/mL come stock di laminina. Conservare il brodo a –20 °C e scongelarlo a 4 °C prima dell'uso.
- Utilizzare una pipetta per trasferire 100 μL di laminina diluita sulla parte superiore di ciascun vetrino coprioggetti e incubare la laminina a 4 °C per 1 h.
nota: Regolare la concentrazione a 5 μg/cm2 per piastre diverse con aree basali diverse. Ad esempio, se l'area basale di un pozzetto da una piastra a 24 pozzetti è di 2 cm2, trasferire 200 μL di laminina diluita in un pozzetto. Ogni cm2 conterrebbe 5 μg di laminina.
- Rimuovere la soluzione di laminina e sciacquare i vetrini coprioggetti con ddH2O una volta. Eseguire questa operazione sul bordo del vetrino coprioggetti per evitare raschiature.
nota: I vetrini coprioggetti rivestiti possono essere conservati a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Raccolta della vescica
- Ottieni ratti Sprague-Dawley di cinque settimane.
- Infonde il carbogeno (95% di ossigeno, 5% di CO2) nella soluzione di Krebs per almeno 30 minuti in un bagno di ghiaccio per raggiungere uno stato di ossigeno e un livello di pH stabili.
- Dopo l'eutanasia tramite lussazione cervicale, immergere i ratti in etanolo al 75% per 30 s per la sterilizzazione.
- Metti i ratti su un asciugamano chirurgico sterilizzato ed esponi il loro addome. Apri la cavità addominale e rivela la vescica con un set di forbici e pinze.
- Sollevare delicatamente la vescica e tagliare la vescica dal collo vescicale con un altro set di forbici e pinze per evitare la contaminazione incrociata. Posizionare rapidamente la vescica in una soluzione di Krebs fredda e stabile all'ossigeno per migliorare la sopravvivenza cellulare.
nota: Una volta rimossa la vescica, eseguire rapidamente le seguenti operazioni per migliorare le prospettive di sopravvivenza dei neuroni.
- Aggiungere la soluzione di Krebs in tre piatti di vetro e becher di vetro.
- Preparare piatti di vetro e bicchieri con la soluzione di Krebs in un bagno di ghiaccio per il pre-raffreddamento.
- Contrassegna questi contenitori con i numeri da 1 a 3 in modo corrispondente per evitare confusione.
- Abbina ogni piatto di vetro con una pinza e un divisore per il nucleo di cucchiai.
- Nel piatto di vetro 1, aprire la vescica con le forbici oftalmiche e aprirla con una pinza e un cucchiaio di divisorio per nucleo.
- Sciacquare la camera d'aria nel bicchiere di vetro 1 e metterla nel piatto di vetro 2.
- Eliminare il grasso aderente sulla superficie del tessuto utilizzando una pinza e forbici oftalmiche in un piatto di vetro 2.
- Sciacquare la camera d'aria nel bicchiere di vetro 2 e metterla nel piatto di vetro 3.
- Raschiare delicatamente la vescica usando la pinza e il divisore del nucleo dei cucchiai sul piatto di vetro 3 per rimuovere gli attacchi esogeni.
- Sciacquare la camera d'aria nel becher di vetro 3, trasferire la camera d'aria in una provetta da centrifuga da 15 mL con 14 mL di soluzione fredda di Krebs e centrifugare il campione per 1 minuto a 356 x g e 4 °C.
- Ripetere il passaggio precedente due volte in altre due provette con la soluzione di Krebs per ridurre la contaminazione.
3. Digestione della vescica in due fasi
- Trasferire la vescica dalla provetta da centrifuga in un flaconcino da 2 mL contenente 1 mL di soluzione digestiva 1. Utilizzare le forbici oftalmiche per tagliare la vescica in piccoli pezzi (più piccoli di 1 mm) in soluzione.
- Miscelare la soluzione vescicale con 9 mL di soluzione digestiva 1 in una piastra sterile per colture cellulari (diametro 100 mm). Eseguire la digestione della fase 1 in un'incubatrice ad agitazione per 1 ora sotto il 5% di CO2, 37 °C e 200 giri/min.
- Dopo la digestione di fase 1, centrifugare la soluzione a 356 x g a 4 °C per 8 minuti.
- Mettere la soluzione di digestione 2 in un bagnomaria a 37 °C per il preriscaldamento.
- Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante che contiene la soluzione di digestione 1 e raccogliere il sedimento cellulare. È consentito un po' di liquido rimanente. La rimozione completa della soluzione può favorire la perdita cellulare.
- Mescolare il sedimento cellulare con la soluzione di digestione calda 2 in una provetta da centrifuga da 15 ml e agitare la miscela mentre si digerisce in un bagno d'acqua a 37 °C per 5 minuti. Non superare i 7 minuti della digestione della fase 2, altrimenti i neuroni periranno.
- Dopo la digestione, disattivare immediatamente la tripsina nella miscela con 10 ml di mezzo di risciacquo freddo.
nota: Eseguire i seguenti passaggi a 0 °C–4 °C. Un bagno di ghiaccio potrebbe fornire tali condizioni.
- Raccogliere il sedimento cellulare dopo la centrifugazione a 356 x g a 4 °C per 8 minuti. Rimuovere quanto più terreno possibile perché la tripsina rimanente danneggia la crescita cellulare.
- Risospendere delicatamente il sedimento con 3 mL di media neuronale. Assicurarsi che non si generino bolle d'aria nella soluzione contenente le cellule per un alto tasso di sopravvivenza.
- Filtrare il terreno di miscelazione attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL.
- Tenere il filtrato su uno shaker a 30 giri/min in un bagno di ghiaccio per 30 minuti. Questo passaggio non è necessario ma consigliato.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 356 x g a 4 °C per 8 minuti e risospendere delicatamente i pellet cellulari in 1 mL di neurone medio A.
- Aggiungere 500 μl di miscela cellulare in ciascun pozzetto della piastra a 48 pozzetti preparata.
- Colture di cellule in incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
- Sostituire tutti i terreni con il neurone medio B in 1 ora per fornire una coltura priva di siero.
- Cambia metà del neurone medio B ogni 3 giorni.
nota: I neuroni sono pronti per gli esperimenti immunocitochimici dopo 5-7 giorni di coltura.
Tabella 1. Composizione della soluzione di Krebs
| ingredienti | Molarità (mM) |
| NaCI | 120 |
| Kci | 5.9 |
| NaHCO3 | 25 |
| Na2HPO4·12H2O | 1.2 |
| MgCI2·6H2O | 1.2 |
| CaCI2 | 2.5 |
| glucosio | 11.5 |
