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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione e rivestimento dei chip multiscomparto
- In una cabina di biosicurezza, posizionare il chip in una capsula di Petri o in un altro contenitore sterile adatto.
- Aggiungere 100 μl di soluzione di pre-rivestimento al pozzetto superiore sinistro del chip e lasciarlo fluire attraverso il canale principale nel pozzetto adiacente.
nota: La soluzione di pre-rivestimento viene utilizzata per pre-rivestire i canali microfluidici per eliminare il potenziale di intrappolamento di bolle d'aria all'interno del chip.
- Riempire il pozzetto in basso a sinistra con 100 μl di soluzione di pre-rivestimento. Attendere 5 minuti per consentire alla soluzione di fluire attraverso i microsolchi.
- Aggiungere 100 μl di soluzione di pre-rivestimento nel pozzetto in alto a destra e lasciarlo fluire attraverso il canale principale nel pozzetto adiacente. Riempire il pozzetto inferiore destro con 100 μl di soluzione di pre-rivestimento.
- Aspirare la soluzione da ogni pozzetto. Aspirare lontano dai canali principali per evitare di rimuovere il liquido dai canali principali (Figura 1A). Aggiungere immediatamente 150 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) nel pozzetto superiore sinistro. Attendere 1,5 min.
cautela: Non aspirare tutto il liquido dai canali principali inclusi.
- Aggiungere 150 μl di PBS nel pozzetto in basso a sinistra. Attendere 5 minuti per consentire ai liquidi di fluire attraverso le microscanalature. Aggiungere 150 μL di PBS nel pozzetto in alto a destra. Aggiungere 150 μl di PBS nel pozzetto in basso a destra. Attendere 10 min.
- Ripetere i passaggi 1.5-1.6 per un secondo lavaggio PBS.
- Controllare il chip al microscopio per colture tissutali per verificare la presenza di bolle nei canali principali. Se sono presenti bolle, eseguire le procedure seguenti. Se non sono presenti bolle, andare al passaggio 1.9.
- Aspirare il PBS dai pozzetti, inclinando la punta della pipetta lontano dall'apertura del canale (Figura 1A).
- Erogare 100 μl di soluzione di pre-rivestimento nel pozzetto superiore, inclinando la punta della pipetta vicino all'apertura del canale (Figura 1B). Le bolle dovrebbero muoversi attraverso il canale nel pozzo inferiore. Attendere 1,5 min.
- Ripetere i passaggi 1.3-1.8.
- Aspirare il PBS dai pozzetti, inclinando la punta della pipetta lontano dall'apertura del canale (Figura 1A).
- Aggiungere 100 μL di 0,5 mg/mL di poli-d-lisina (PDL) nel pozzetto superiore sinistro del chip. Attendere 1,5 min. Riempire il pozzetto in basso a sinistra con 100 μL di PDL.
- Aggiungere 100 μl di PDL nel pozzetto superiore destro del chip. Attendere 1,5 min. Aggiungere 100 μl nel pozzetto in basso a destra.
- Chiudere la capsula di Petri e mettere il chip in un'incubatrice a 37 °C per 1 ora.
- Ripetere due volte i passaggi di lavaggio PBS 1.5-1.6 per rimuovere il PDL in eccesso.
- Aspirare il PBS dal dispositivo.
- Aggiungere immediatamente 100 μl di terreno di coltura cellulare nel pozzetto superiore sinistro del chip. Attendere 1,5 min. Aggiungi i file multimediali nell'area in basso a sinistra. Aggiungi i file multimediali nell'area in alto a destra. Attendere 1,5 min. Aggiungere 100 μl di terreno nel pozzetto inferiore destro del chip.
- Posizionare il chip nell'incubatore a 37°C fino al momento di placcare le cellule.
2. Seminare i Neuroni nei Chip Multicompartimentali
- Preparare la sospensione cellulare di neuroni ippocampali dissociati di ratto secondo i protocolli stabiliti per ottenere una densità di ~12 × 106 cellule/mL.
nota: È possibile utilizzare densità di sospensione cellulare comprese tra 3 e 12 × 106 cellule/mL. Se si utilizza una densità inferiore, il volume della sospensione cellulare da aggiungere al chip può essere aumentato. La procedura descritta di seguito è applicabile ai neuroni corticali o ippocampali dissociati murini. Le densità cellulari ottimali per altri tipi di neuroni possono variare.
- Rimuovere la maggior parte del terreno in ciascun pozzetto del chip, lasciando circa 5 μl in ciascun pozzetto. Aspirare lontano dai canali principali per evitare di rimuovere il liquido dai canali principali (Figura 1A).
cautela: Non aspirare liquidi dai canali principali in dotazione. Le bolle d'aria possono rimanere intrappolate nel chip se il fluido viene aspirato dai canali principali.
- Caricare 5 μL di sospensione cellulare nel pozzetto in alto a destra e altri 5 μL di sospensione in cella nel pozzetto in basso a destra (~120.000 celle in totale). Caricare le celle erogandole vicino al canale principale (Figura 1B). Controlla al microscopio per assicurarti che i neuroni siano nel canale principale. Attendere 5 minuti per consentire alle celle di attaccarsi.
nota: I neuroni possono essere caricati in entrambi i compartimenti. A scopo esplicativo, il compartimento somatico è il canale principale sul lato destro, ma entrambi i compartimenti possono essere utilizzati come compartimento somatico. È possibile utilizzare densità di celle inferiori, fino a 60.000 celle per chip. Fino a 10 μl di sospensione cellulare possono essere aggiunti a ciascun pozzetto del compartimento somatico in combinazione con una sospensione cellulare con un numero di cellule inferiore a quello descritto sopra.
- Aggiungere circa 150 μL di terreno di coltura neuronale a ciascuno dei pozzetti superiore e inferiore destro, quindi aggiungere 150 μL di terreno a ciascun pozzetto superiore e inferiore sinistro. Inserire il truciolo nel vassoio umidificato in un'incubatrice al 5% di CO2 a 37 °C.
- Dopo 24 ore, eseguire un cambio del terreno rimuovendo il terreno dai pozzetti. Assicurarsi che il canale principale rimanga pieno. Aggiungere 150 μl di terreno in ciascun pozzetto superiore, quindi riempire i pozzetti inferiori.
- Riposizionare il chip nell'incubatrice per il numero di giorni desiderato.
nota: Monitora i supporti ogni pochi giorni per assicurarti che rimangano rosa chiaro. Se il supporto è giallastro, sostituirne il 50% con un supporto nuovo. Se il livello del fluido è basso, garantire un'umidità adeguata e un adeguato contenimento secondario dei trucioli per evitare l'evaporazione. È possibile ridurre al minimo o eliminare le modifiche dei supporti utilizzando il contenimento secondario e/o coprendo la piastra contenente il chip con film di politetrafluoroetilene (PTFE)-FEP.
