Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Prepara le Soluzioni per gli Esperimenti
- Preparare la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) (vedere la tabella dei materiali): Scongelare la miscela ECM con ghiaccio. Diluire la miscela ECM 1:10 in terreno di coltura basico (senza fattori neurotrofici o siero fetale bovino (FBS)) e conservare in ghiaccio.
- Preparare il terreno di coltura (vedere la tabella dei materiali): Preparare una scorta di terreno neurobasale non contenente FBS o fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF). Integrare i terreni neurobasali con FBS fresco (10%) e BDNF (5 ng/ml) appena prima di aggiungerli alla coltura cellulare.
- Preparare la soluzione extracellulare (vedi Tabella dei materiali).
2. Lavaggio e sterilizzazione dei MEA
NOTA: I MEA utilizzati per gli esperimenti contengono 68 elettrodi disposti in una griglia rettangolare (Figura 1E). Ogni elettrodo ha una dimensione di 40 x 40 μm2 con una spaziatura di 200 μm da centro a centro. Gli elettrodi sono realizzati in platino. Gli elettrodi sono collegati ai contatti corrispondenti da un circuito in ossido di indio-stagno. Questo circuito è isolato da uno strato di 5 μm di SU-8. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli sul fornitore. Altri layout MEA possono essere adatti per questi esperimenti.
- Per i nuovi MEA: Sciacquarli immergendoli in etanolo al 70% per 30 sec e lavarli con acqua distillata per 30 sec. Lavorare in una cappa a flusso laminare.
- Lasciare asciugare il MEA per 30 minuti in una cappa a flusso laminare.
- Mettere ogni MEA in una capsula di Petri sterile individuale (35 mm x 10 mm) e sigillare con un foglio. I MEA possono essere conservati fino al momento dell'utilizzo.
- Per i MEA usati: Incubare i MEA in una piastra di Petri (35 mm x 10 mm) contenente 1 ml di soluzione enzimatica (vedi Tabella dei materiali) O/N su agitatore orbitale a RT per rimuovere il materiale biologico. Quindi continuare come nel passaggio 2.1.
nota: Maneggiare i MEA con cura utilizzando una pinza con punte rivestite in gomma.
3. Preparazione dei MEA per gli esperimenti di coltura
- Rimuovere la pellicola sigillante e lasciare il MEA nella capsula di Petri (35 mm x 10 mm) per l'intero esperimento.
- Rivestire i MEA con la soluzione preparata al punto 1.1: Utilizzare un puntale per pipetta freddo da 200 μl (conservato a -20 °C) per pipettare 50 μl di soluzione di rivestimento in ciascun MEA, coprendo l'intera area dell'elettrodo.
- Lasciare rivestire i MEA per 30 minuti a 1 ora a RT.
- Rimuovere la soluzione di rivestimento utilizzando una pipetta. Applicare 100 μl di terreno di coltura integrato con il 10% di FBS e 5ng/ml di BDNF e lasciarlo in RT fino alla placcatura del tessuto.
- Mettere 2 piastre di Petri contenenti i MEA rivestiti in una capsula di Petri grande (94 mm x 16 mm) e aggiungere una terza capsula di Petri piccola contenente 1,5 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per l'umidificazione.
nota: L'aggiunta di una piccola capsula di Petri (passaggio 3.5) contenente PBS è fondamentale per ridurre significativamente l'evaporazione del terreno di coltura.
4. Dissezione del ganglio spirale
NOTA: La dissezione grossolana può essere eseguita al di fuori della cappa a flusso laminare (passaggi da 4.1 a 4.4). Per la dissezione fine sono obbligatorie condizioni sterili (cappa a flusso laminare) (dal passaggio 4.5).
- Eutanasia degli animali (topi di 5-7 giorni) mediante decapitazione senza anestesia preventiva.
- Sterilizzare la testina spruzzando con etanolo al 70%.
- Tenendo la testa, tagliare la connessione tra la pelle e il cranio con una forbice affilata/affilata lungo la linea sagittale.
- Taglia il cranio agittalmente e rimuovi il cervello usando forbici affilate/smussate.
- Taglia le ossa temporali dal cranio e mettile in una capsula di Petri contenente una soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) sterile ghiacciata.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, sezionare la bolla timpanica utilizzando una pinza fine e isolare l'orecchio interno.
- Rimuovere l'osso della coclea, usando una pinza fine.
- Rimuovere il legamento spirale e la stria vascolare (SV) insieme tenendo con una pinza la porzione basale del ganglio spirale (SG) e la SV e svolgendo lentamente la SV dalla base all'apice
- Isolare l'organo di Corti (OC), il SG e il modiolo (Figura 1A-C).
- Separare l'OC dal SG e dal modiolo tenendo con una pinza la porzione basale del SG e dell'OC e svolgendo lentamente l'OC dalla base all'apice.
- Tagliare gli espianti laterali (da 200 a 500 μm di diametro) dal ganglio a spirale ancora attaccato al modiolo (Figura 1D) utilizzando una pinza e un micro bisturi.
5. Coltura di espianti di gangli a spirale su MEA
- Posizionare due espianti di ganglio a spirale accanto agli elettrodi sul MEA precedentemente preparato con 100 μl di terreno di coltura.
- Posizionare l'organo di Corti a circa 5 mm di distanza dall'area dell'elettrodo.
- Utilizzare una pinza per fissare gli espianti e l'organo di Corti sul MEA evitando di danneggiare il tessuto.
- Posizionare con cura i MEA nell'incubatore e coltivarli a 37 °C e 5% di CO2. Il giorno successivo, ispezionare visivamente che gli espianti siano attaccati al MEA.
nota: Se gli espianti non hanno attaccato O/N, raramente lo faranno nei prossimi giorni. L'OC viene posizionato adiacente alla coltura per il supporto trofico/neurotrofico.
- Aggiungere 100 μl di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e BDNF al giorno per 5 giorni consecutivi.
- Il giorno 6, aggiungere 2 ml di terreno di coltura contenente il 10% di FBS e 5 ng/ml di BDNF e coltivare il tessuto per altri 13 giorni.
