1. Semina di astrociti per la riprogrammazione
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti sotto una cabina di sicurezza biologica con un livello di sicurezza 1 (SL1).
- Preparare piastre a 24 pozzetti con vetrini coprioggetti rivestiti di poli-D-lisina nello stesso modo in cui venivano preparati in precedenza i flaconi di coltura. Per determinare il numero di piastre necessarie, si consideri che gli astrociti sono placcati a una densità di 5-5,5 x 104 celle per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Di solito, isolando sei topi del midollo spinale dal giorno 2 postnatale (P2) si ottengono circa 1 x 106 cellule.
- Aspirare i terreni dai flaconi di coltura T25 contenenti gli astrociti coltivati e lavare una volta con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Staccare gli astrociti dal pallone di coltura aggiungendo 0,5 mL di tripsina/acido etilendiamminotetraacetico allo 0,05% (EDTA) e incubare a 37 °C per 5 minuti. Picchiettare delicatamente il lato del pallone per rilasciare le cellule dalla superficie del pallone di coltura e controllare il distacco al microscopio a campo chiaro utilizzando un ingrandimento 10X.
- Interrompere la tripsinizzazione con 2,5 mL di terreno di coltura per astrociti e raccogliere la sospensione cellulare in provette da 15 mL. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di coltura per astrociti. Calcola la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o un sistema di conteggio cellulare automatizzato.
- In base al numero di cellule, diluire la sospensione cellulare con terreno astrocitario fresco per ottenere una soluzione di 1-1,1 x 105 cellule per mL. Integrare il terreno con il fattore di crescita epidermico (EGF) e il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) a 10 ng/mL per fattore. Aggiungere 500 μl di sospensione cellulare, equivalenti a 5-5,5 x 104 cellule, a ciascun pozzetto delle piastre da 24 pozzetti precedentemente preparate e delle cellule di coltura a 37 °C e 5% di CO2.
2. Espressione forzata dei fattori di trascrizione
NOTA: Prima di procedere con il protocollo, è essenziale progettare correttamente l'esperimento. In particolare, è importante includere sempre un controllo negativo per la riprogrammazione, ovvero una condizione in cui non viene espresso alcun fattore di riprogrammazione. Ad esempio, quando si utilizzano vettori che trasportano il cDNA per il fattore di riprogrammazione e un reporter (ad esempio, proteina fluorescente verde (GFP), DsRed), il controllo negativo è rappresentato dallo stesso vettore che trasporta solo il reporter. Quando si esprimono più fattori che portano diversi reporter, il controllo negativo deve essere regolato di conseguenza.
- Il giorno dopo la placcatura, ispezionare le piastre a 24 pozzetti per assicurarsi che le cellule abbiano aderito ai vetrini.
- Sulla base dell'obiettivo sperimentale e delle risorse disponibili, l'espressione forzata dei fattori di riprogrammazione può essere ottenuta mediante trasduzione virale (vedi passaggio 2.3) o trasfezione del DNA (vedi passaggio 2.4).
NOTA: L'uso di retrovirus o lentivirus richiede l'approvazione delle autorità governative e deve essere eseguito in una cabina di sicurezza biologica all'interno di un laboratorio con livello di sicurezza 2 (SL2).
- Riprogrammare gli astrociti trasducendo le cellule con il retrovirus o il lentivirus che trasportano l'informazione genetica per esprimere il fattore o i fattori di riprogrammazione di interesse come descritto di seguito.
- Trasdurre cellule con un alto titolo virale di 1 x 1010-1 x 1012 particelle/mL aggiungendo 1 μL della sospensione cellulare direttamente al terreno degli astrociti. Ciò garantisce un alto tasso di infezione. Coltivare le cellule con il terreno degli astrociti contenente particelle virali a 37 °C per 24-36 ore prima di procedere con la sezione 3, a seconda dello scopo dell'esperimento.
NOTA: Diversi promotori possono essere utilizzati per guidare l'espressione dei transgeni (vedi anche Risultati rappresentativi). I promotori costitutivi (ad esempio, citomegalovirus (CMV), β-actina di pollo (CAG)} inducono l'espressione del transgene prima dei promotori inducibili; Tuttavia, entrambi i tipi di promotori sono stati utilizzati con successo per riprogrammare le cellule in neuroni.
- I plasmidi del DNA possono anche essere introdotti negli astrociti tramite trasfezione del DNA come descritto di seguito.
nota: Questo può essere fatto sotto una cappa di sicurezza biologica approvata per SL1.
- Prima della trasfezione, procurarsi il reagente di trasfezione, un DNA plasmidico dei costrutti desiderati, un terreno astrocitario fresco e un terreno siero-ridotto (vedi Tabella dei materiali). Calcolare la quantità richiesta di terreno siero-ridotto (vedere la Tabella dei materiali) considerando che ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti richiede 300 μL di terreno siero-ridotto. Aggiungere la quantità appropriata di terreno a ridotto contenuto di siero in una provetta da 50 ml e riscaldarla a 37 °C.
- Quando il terreno siero-ridotto è caldo, aspirare il terreno astrocitario da tutti i pozzetti e raccoglierlo in una provetta da 50 mL. Filtrare il terreno degli astrociti raccolto con un filtro a siringa da 0,45 μM per rimuovere le cellule staccate.
- Aggiungere un volume uguale di terreno per astrociti fresco al terreno filtrato per ottenere una soluzione sufficiente per aggiungere 1 mL di terreno per astrociti per pozzetto. Mantenere il terreno condizionato con astrociti nell'incubatore a 37 °C fino all'uso (passaggio 2.4.9).
nota: Il terreno di coltura viene riutilizzato in quanto contiene diversi fattori secreti che supportano la vitalità della coltura.
- Aggiungere 300 μl di terreno a siero ridotto preriscaldato in ciascun pozzetto e riposizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatore.
- Preparare la soluzione A, costituita da DNA e terreno siero-ridotto. Per ogni pozzetto, utilizzare un totale di 0,6 μg di DNA e aggiungerlo a 50 μL di terreno siero-ridotto. Conservare la soluzione A a temperatura ambiente fino al momento dell'uso.
NOTA: In genere, viene preso in considerazione un triplice testo tecnico per condizione. Pertanto, viene preparata una miscela sufficiente per la reazione a 3,5 (ad esempio, 2,1 μg di DNA totale diluito in 175 μL di terreno siero-ridotto) per garantire materiale sufficiente per trasfettare tre pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
- Preparare la soluzione B, composta dal reagente di trasfezione e dal terreno siero-ridotto. Per ogni pozzetto, aggiungere 0,75 μL di reagente di trasfezione a 50 μL di terreno siero-ridotto. Poiché questa soluzione è comune a tutte le condizioni di trasfezione, prepararla in blocco per ridurre la variabilità tra le trasfezioni.
- Incubare la soluzione B a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere la soluzione B alla soluzione A goccia a goccia in rapporto 1:1 e mescolare delicatamente. Non vortice. Incubare la soluzione A+B per 20-30 minuti a temperatura ambiente sotto la cappa.
- Ripetere i passaggi 2.4.5-2.4.7 per tutte le condizioni di trasfezione. Dopo 20-30 minuti, aggiungere la soluzione A+B a ciascun pozzetto goccia a goccia per un volume finale di 100 μL. Agitare delicatamente la piastra e riposizionare le cellule nell'incubatore a 37 °C per 4 ore.
- Dopo 4 ore, rimuovere il terreno di trasfezione e aggiungere 1 mL del terreno condizionato con astrociti preriscaldato preparato al punto 2.4.3. Mantenere le cellule per 36-48 ore prima di procedere con la sezione 3, a seconda dello scopo dell'esperimento.
3. Riprogrammazione degli astrociti (analisi di 7 giorni)
- Preparare il terreno di differenziazione neuronale aggiungendo 1 mL di integratore di B27 a 49 mL di terreno di coltura di base. Dopo 24-48 ore, a seconda che le cellule siano state trasdotte o trasfettate (vedere rispettivamente i passaggi 2.3 e 2.4), sostituire il terreno astrocitario con 1 mL di terreno di differenziazione neuronale per pozzetto e coltivare le cellule a 37 °C e 9% di CO2,
NOTA: Le cellule possono anche essere mantenute al 5% di CO2 se non è disponibile un incubatore al 9% di CO2. Tuttavia, la riprogrammazione neuronale è più efficiente in queste condizioni.
- Opzionale: per aumentare l'efficienza della riprogrammazione, integrare il terreno di differenziazione neuronale con Forskolina (concentrazione finale di 30 μM) e Dorsomorfina (concentrazione finale di 1 μM) quando si sostituisce il mezzo astrocitario al mezzo di differenziazione. Quando si sceglie di trattare le cellule con Forskolina e Dorsomorfina, somministrare una seconda dose di Dorsomorfina 2 giorni dopo il trattamento iniziale. Aggiungere questo secondo trattamento direttamente al terreno di coltura.
La - riprogrammazione diretta degli astrociti murini in cellule neuronali avviene normalmente entro 7 giorni dal cambio del mezzo (Figura 1). Quindi, 7 giorni dopo l'inizio della riprogrammazione neuronale, fissare o raccogliere le cellule per l'analisi a valle.
