Preparazione di fette di cervello a cuneo per visualizzare i neuroni uditivi

Abstract

Fonte: Fischl, M. J. et al., Preparazione di fette di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo.J. Vis. Exp.(2020)

Questo video mostra il processo di preparazione di fette di cervello a forma di cuneo in un ambiente di laboratorio. Utilizzando un vibratomo, viene realizzata una fetta a forma di cuneo del cervello di un topo con spessore variabile. Questa fetta contiene la radice nervosa uditiva posizionata all'estremità più spessa, mentre i neuroni relativi all'udito si trovano all'estremità più sottile.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Rimozione del cervello con radice nervosa uditiva intatta per la stimolazione

NOTA: I topi per questi esperimenti sono stati ottenuti incrociando topi transgenici ChAT-IRES-Cre su uno sfondo C57BL/6J con topi reporter tdTomato (Ai14). I topi utilizzati per l'istologia e l'elettrofisiologia erano ad esordio post-uditivo (P14-P23), che è intorno a P12 nei topi. I neuroni che esprimono tdTomato nel nucleo v....

Results

Figura 1: Schema della fetta a cuneo e immagine di esempio. (A) Schema del circuito di retroazione olivocochlare mediale. Le frecce blu indicano il percorso ascendente afferente ai neuroni MOC e le frecce nere indicano il percorso di feedback discendente dai neuroni MOC alla base delle cellule ciliate esterne (OHC). (B) Immagine in campo chiaro di una fetta di cuneo .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Preparazioni sperimentali
Agar, polvere	Fisher Scientifico	BP1423500	Blocco di agar al 4% utilizzato per stabilizzare il tessuto cerebrale durante il sezionamento del vibratomo
AlexaFluor Idrazide 488	Invitrogen	Codice: A10436	Fluoroforo utilizzato nella soluzione interna per confermare il successo del patch per neuroni MOC
Bilancia analitica	Geneses Scientific (Intramalls)	AV114	Pesatura di prodotti chimici
Lama di rasoio a doppio taglio	Ted Pella	121-6	Lama da taglio a vibratomo
Acido chinurenico (5g)	Sigma Aldrich	K3375-5G	Additivo ACSF per affettare utilizzato per ridurre l'attività dei neuroni durante la dissezione e l'affettatura al fine di migliorare la salute dei tessuti per il bloccaggio del cerotto
Misuratore di pH	Fisher Scientific (Intramalls)	Codice 13-620-451	Tester di pH in soluzione
Piastre di Petri in plastica 100 mm diametro X 20 mm	Fisher Scientific (Intramalls)	12-556-002	4% Preparazione dell'agar
Piastra riscaldante di agitazione	Fisher Scientific (Intramalls)	11-500-150	Riscaldamento per la preparazione di agar al 4%
Dissezione e Affettatura
Biocitina	Sigma Aldrich	B4261-250MG	Sostanza chimica utilizzata per il tracciamento assonale (coniugata a streptavidina 488)
Microscopio da dissezione	Amscope	SM-1BN	Per una dissezione di precisione durante la rimozione del cervello
Pinze Dumont #5	Strumenti per la scienza	Codice 11252-20	Strumento di dissezione con pinza fine
Pinzette economiche #3	WPI	501976	Strumento di dissezione con pinza
Piastra Petri in vetro 150 mm di diametro x 15 mm di altezza	Fisher Scientific (Intramalls)	08-747E	Piatto di dissezione
Carta di interfaccia (203 x 254 mm PCTE Membrana 10um)	Thomas Scientific	1220823	Incubazione a fette/applicazione di biocitina
Leica VT1200S Vibratomo	Leica	Codice 1491200S001	Vibratomo per il sezionamento di fette a cuneo
Forbici Mayo	Roboz	RS-6872	Strumento di dissezione
Lame in acciaio al carbonio a taglio singolo	Fisher Scientific (Intramalls)	12-640	Lama di rasoio per dissezione
Disco per campioni, orientamento	Leica	14048142068	Tavolino vibrante specializzato per un'inclinazione riproducibile
Spoonula	FisherSci	Codice 14-375-10	Strumento di dissezione
Super colla	Newegg	Codice: 15187	Utilizzato per incollare il tessuto al tavolino del vibratomo
Vannas Forbici a molla	Strumenti per la scienza	Codice 91500-09	Strumento di dissezione