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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Rimozione del cervello con radice nervosa uditiva intatta per la stimolazione
NOTA: I topi per questi esperimenti sono stati ottenuti incrociando topi transgenici ChAT-IRES-Cre su uno sfondo C57BL/6J con topi reporter tdTomato (Ai14). I topi utilizzati per l'istologia e l'elettrofisiologia erano ad esordio post-uditivo (P14-P23), che è intorno a P12 nei topi. I neuroni che esprimono tdTomato nel nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB) sono stati precedentemente caratterizzati come neuroni olivocochloari mediali (MOC) in questa linea di topi.
- Eutanasia (ad esempio, asfissia da CO2) e decapitare l'animale utilizzando procedure istituzionali approvate.
- Usando una lama di rasoio, taglia la pelle sulla linea mediana del cranio dal naso alla parte posteriore del collo. Staccare la pelle per esporre il cranio.
- Usando piccole forbici, praticare un'incisione nel cranio attraverso la linea mediana, partendo dalla base (estremità caudale vicino al midollo spinale) del cranio e continuando verso il naso.
- Alla sutura lambda, praticare dei tagli nel cranio dalla linea mediana, lateralmente verso l'orecchio su entrambi i lati. Stacca il cranio per esporre il cervello.
- Partendo dall'estremità rostrale, solleva delicatamente il cervello dal cranio con una piccola spatola da laboratorio o una pinza smussata. Taglia il nervo ottico e continua a lavorare delicatamente il cervello all'indietro, esponendo la superficie ventrale.
- Tagliare i nervi trigemino pizzicandoli con una pinza sottile vicino alla superficie ventrale del tronco encefalico.
nota: Fallo con attenzione, poiché il nervo vestibolococleare si trova appena sotto e deve essere intatto per un'eventuale stimolazione.
- Mettere il preparato in una capsula di Petri di vetro riempita con una soluzione fredda per affettare. Posizionare il piatto sotto un microscopio da dissezione. Bollire delicatamente con il carbogeno.
- Taglia il nervo facciale vicino al tronco encefalico ed esponi il nervo vestibolococleare.
- Usando una pinza fine, spingere le punte nei forami dove il nervo vestibolococleare esce dal cranio il più lontano possibile e pizzicare il nervo per reciderlo, lasciando la radice nervosa attaccata al tronco encefalico. Ripeti l'operazione sull'altro lato.
- Una volta che entrambe le radici nervose sono libere, rimuovere le meningi e il sistema vascolare dalla superficie ventrale del tronco encefalico vicino al corpo trapezoidale.
- Libera completamente il cervello dal cranio pizzicando i nervi cranici rimanenti e il tessuto connettivo, avendo cura di preservare il midollo spinale rimanente, se possibile.
2. Blocca e monta il cervello sul palco (disco magnetico)
- Preparare la superficie del cervello a fissarsi al tavolino bloccando il cervello a livello del chiasma ottico.
- Con la superficie ventrale rivolta verso l'alto, stabilizzare il cervello utilizzando uno strumento smussato per immobilizzare delicatamente il midollo spinale in modo che il cervello non si inclini durante il passaggio successivo.
- A livello del chiasma ottico, usa una pinza aperta per creare il piano per bloccare il cervello inserendolo attraverso il cervello fino al fondo del piatto. Inserire la pinza con un angolo di circa 20° rispetto alla verticale in modo che le punte escano dalla superficie dorsale del cervello caudale verso il chiasma ottico.
- Taglia lungo la pinza usando la lama del rasoio.
- Incolla il cervello alla superficie del palco.
- Preparare un piccolo blocco (~1 cm3) di agar al 4% per sostenere il cervello.
- Metti una piccola goccia di colla sul palco e stendila in un rettangolo in modo che sia il cervello che il blocco di agar possano essere incollati.
- Usando una pinza, solleva con cautela il cervello e tampona delicatamente il liquido in eccesso usando il bordo di un tovagliolo di carta. Posizionare la superficie bloccata sulla colla, la superficie ventrale sarà rivolta verso la lama durante l'affettatura.
- Spingere delicatamente il blocco di agar contro la superficie dorsale del cervello per sostenerlo durante l'affettatura e per garantire il corretto posizionamento del cervello (cioè l'angolo).
3. Affetta il cervello per creare una fetta a cuneo
NOTA: Prepara una fetta di cervello usando un vibratomo che ha la radice del nervo cocleare sul lato spesso e i neuroni olivocochloari mediali (MOC) e il nucleo mediale del corpo trapezoidale (MNTB) sul lato sottile.
- Posiziona il disco magnetico con il cervello attaccato sulla base del tavolino e posizionalo nella camera di affettatura con la superficie ventrale del cervello orientata verso la lama.
- Riempire la camera con una soluzione per affettare ghiacciata e bollire con carbogeno.
- Abbassare la lama nella soluzione e tagliare le fette caudali nella regione di interesse per assicurarsi che le fette siano simmetriche. Se le fette appaiono asimmetriche, inclinare leggermente il tavolino per ottenere la simmetria.
nota: La velocità della lama compresa tra 0,05 e 0,10 mm/s è stata efficace per il taglio di fette sane e può variare a seconda dell'età dell'animale e della regione del cervello.
- Una volta che le fette sono simmetriche, spostare il tavolino di ~15° (corrispondente a circa 3 anelli concentrici sulla base del palco) da un lato.
nota: Sposta il tavolino lontano dalla radice nervosa uditiva che vuoi preservare nella fetta.
- Continua ad affettare con cura fino a quando la radice del nervo uditivo non è vicina alla superficie su un lato e il nervo facciale può essere visto sulla superficie dell'altro lato.
- Riportare il tavolino indietro di 15° nella posizione originale.
- Allontanare la lama dal tessuto e ruotare la base del tavolino di 90° in modo che il bordo laterale del lato sottile sia rivolto verso la lama. Abbassare la lama di diverse centinaia di micron e poi avvicinare lentamente la lama al bordo del tessuto. Ripetere l'operazione fino a quando la lama tocca il bordo laterale. Abbassare la lama allo spessore desiderato del bordo sottile della fetta, qui altri duecento micron.
nota: La fetta risultante ha idealmente uno spessore di ~300 mm a livello del nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB) sul lato in cui avverrà il patch clamping.
- Allontanare la lama dal tessuto e ruotare la base del tavolino all'indietro in modo che la superficie ventrale sia rivolta verso di essa.
- Esegui il taglio che designa la superficie rostrale della fetta a cuneo. Trasferire la fetta su un foglio di carta d'interfaccia (1 cm2) con la superficie caudale rivolta verso il basso. Spostare la fetta nella camera di incubazione o in un altro apparecchio di incubazione adatto per il recupero (30 minuti a 35 °C).
nota: Il nervo facciale dovrebbe essere visibile su entrambi gli emisferi della fetta sulla superficie rostrale (vedi Figura 1B).
