Stimolare la differenziazione delle cellule neuronali utilizzando nanobarre d'oro

Abstract

Fonte: Paviolo., et al. Stimolazione ottica assistita da nanobarre d'oro di cellule neuronali. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video dimostra una tecnica per promuovere la differenziazione neuronale esponendo le cellule nervose a nanobarre d'oro e luce laser, che forma proiezioni cellulari supportate dalla βIII-tubulina. La colorazione e l'osservazione della tubulina e del nucleo cellulare con la microscopia a epifluorescenza rivela le escrescenze cellulari, indicando l'efficacia dei nanorod nella differenziazione neuronale.

Protocollo

1. NG108-15 Coltura e differenziazione di linee cellulari neuronali

1. Per il terreno di coltura cellulare, preparare 500 ml di terreno sterile Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% (p/v) di siero fetale di vitello (FCS), l'1% (p/v) di L-glutammina, l'1% (p/v) di penicillina/streptomicina e lo 0,5% (p/v) di amfotericina B.
   Nota: gli integratori possono essere quotati in aliquota, conservati a -20 °C e aggiunti al supporto nel giorno richiesto. Il terreno di coltura cellulare può essere refrigerato in condizioni sterili per un massimo di 1 mese.
2. Per il terreno di differenziazione cellulare, preparare 50 ml di DMEM sterile contenente l'1% (p/v) di L-glutammina, l'1% (p/v) di penicillina/streptomicina e lo 0,5% (p/v) di amfotericina B.
3. Coltivare cellule neuronali NG108-15 in 10 ml di terreno di coltura cellulare in fiasche T75 in polistirene in un incubatore con atmosfera umidificata (5% CO2 a 37 °C). Normalmente, seminare 1,5-2 × 10⁵ celle in ogni pallone per essere pronti in 3-4 giorni. Cambiare il terreno di coltura cellulare ogni due giorni.
   Nota: per prevenire derive o variazioni genetiche, non utilizzare cellule più vecchie del passaggio 21 per gli esperimenti.
4. Quando il 70-80% è confluente in coltura, sostituire il terreno con un terreno di coltura cellulare fresco caldo. Staccare meccanicamente le cellule battendo delicatamente il fondo del pallone confluente. Non usare la tripsina.
5. Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 600 x g e risospendere il pellet cellulare in 2 ml di terreno di differenziazione cellulare caldo.
6. Seminare 2 × 10⁴ cellule/cm² in una piastra di polistirene per colture tissutali a 96 pozzetti con 200 μl di terreno di differenziazione cellulare. Incubare l'esperimento per 1 giorno al 5% di CO2 / 37 °C.
7. Aggiungere tra 3,2 × 10⁹ - 4,2 × 10¹⁰ particelle/ml di soluzione di nanorod d'oro (Au NR) il giorno 2 e incubarla per altre 24 ore. Non aggiungere le particelle per gli esperimenti di controllo.
   Nota: Come controllo alternativo, le nanoparticelle d'oro (Au NP) con una lunghezza d'onda di assorbimento di picco ben differenziata possono essere utilizzate a scopo di confronto, per un comportamento cellulare più coerente, mantenere costante la densità cellulare e non modificare la superficie del pozzetto prima della semina cellulare.

2. Miglioramento della crescita neurita

1. Accoppiare il laser con una fibra ottica monomodale (apertura numerica = 0,13) e terminarla con un connettore in fibra (i connettori FC sono convenienti e comunemente disponibili). Misura la potenza del laser in uscita con un misuratore di potenza standard. Per ottenere i risultati più efficaci, abbinare la lunghezza d'onda di picco del laser al picco di risonanza plasmonica degli NR.
2. Il giorno 3 dopo l'incubazione NR, fissare il connettore FC al pozzetto. Irradia campioni e controlli a RT per 1 minuto in onda continua per diverse potenze laser. Lasciare procedere la coltura per altri 3 giorni al 5% di CO2 / 37 °C. Ripetere l'irradiazione laser per un minimo di 3 misurazioni indipendenti.
   Nota: A seconda dell'applicazione, è possibile selezionare tempi di irradiazione e frequenze degli impulsi diversi.
3. Caratterizzare il laser in termini di diametro del raggio e irradianza laser (W∙cm-2).
   1. Per una fibra monomodale standard, utilizzare NA = n∙sinθ, dove n è l'indice di rifrazione del mezzo in uso e θ è il semiangolo del cono di luce che esce dalla fibra (vedi Figura 1A). Dalla trigonometria, r = tanθ∙d, dove r è il raggio del fascio e d è la distanza tra la fibra e il campione. Il connettore FC corrisponde al diametro del pozzetto, illuminando quindi il campione a una distanza d = 2,70 ± 0,20 mm. La luce esce dalla fibra in acqua (n = 1,33), dando r = tan(sin-1(NA/n))∙d.
   2. Utilizzando quest'ultima equazione, calcolare il raggio del raggio laser, l'area del raggio corrispondente e l'irradianza laser media (potenza laser divisa per l'area del raggio) sul bersaglio (vedere il grafico di esempio nella Figura 1B). Questi valori rappresentano l'irraggiamento medio sull'area illuminata.
   3. Valutare gli errori per le misure con la teoria generale della propagazione dell'errore.
      Nota: La distanza tra il connettore FC e il campione può essere misurata mediante fotografie della disposizione sperimentale e post-elaborazione dell'immagine utilizzando un software appropriato (ad es. ImageJ).
4. Al 5° giorno, rimuovere il mezzo di differenziazione cellulare dagli esperimenti e fissare i campioni con una soluzione di formaldeide al 3,7% (v/v) per 10 minuti, quindi permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,1% (v/v) per 20 minuti.
5. Aggiungere il 3% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) ai campioni per 60 minuti per bloccare i siti di legame delle proteine non reagiti. Etichettare i campioni per l'anti-βIII-tubulina durante la notte (5 μg/ml in PBS integrato con l'1% di BSA) a 4 °C.
6. Incubare le cellule per 90 minuti al buio con un anticorpo secondario appropriato (ad es. anticorpo IgG di topo coniugato TRITC (Tetrametilrodamina)) utilizzando una concentrazione di 0,4-2 μg/ml nell'1% di BSA in PBS. Etichettare i nuclei cellulari con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) (0,1 μg/ml in acqua deionizzata) per 10 min.
   Nota: la coniugazione e la concentrazione degli anticorpi possono variare in base al protocollo aziendale. Lavare i campioni con PBS due volte per 5 minuti dopo ogni fase di colorazione.
7. Immagini di campioni mediante epifluorescenza o microscopia confocale utilizzando un obiettivo di almeno 20×. Scegliere i filtri del microscopio in base all'anticorpo secondario. Selezionare un filtro DAPI (λEX = 358 nm; λEM = 488 nm) per visualizzare i nuclei cellulari.
8. Analizzare le immagini valutando: i) la lunghezza massima del neurite (registrare la lunghezza dalla punta del neurite all'inizio del corpo cellulare), ii) il numero di neuriti per cellula neuronale (sommare tutti i neuriti per cellula) e iii) la percentuale di cellule con neuriti (dividere il numero totale di cellule che esprimono βIII-tubulina per il numero totale di cellule con un nucleo colorato positivamente)

Risultati

Figura 1. Configurazione sperimentale in fibra ottica (A) e irradianze laser medie in funzione della potenza del laser per un raggio laser di area pari a 0,4 mm2 (B). I parametri del fascio sono (A): il semiangolo del cono massimo di luce in uscita dalla fibra (θ), il raggio del fascio (r) e la distanza tra la fibra ottica e il campione (d).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Au NR	Sigma Aldrich	716812
NG108-15	Sigma Aldrich	8811230
DMEM	Sigma Aldrich	D6546
Fcs	Tecnologie per la vita	10100147
L-glutammina	Sigma Aldrich	G7513
Penicillina/streptomicina	Tecnologie per la vita	15140122
Amfotericina B	Tecnologie per la vita	15290018
Formaldeide	Sigma Aldrich	F8775
Triton X-100	BDH	T8532
Bsa	Sigma Aldrich	Codice: A2058
Anti-βIII-tubulina	Promega	G7121
Anticorpo IgG anti-topo coniugato TRITC	Sigma Aldrich	Codice: T5393
DAPI	Invitrogen	D1306
spettrometro UV-Vis	Sistemi medici Varian Inc.	Cary 50 Bio
Mini centrifuga	Eppendorf	Mini Giro
Bagno sonico	Unisonics Australia	FPX 10D
Incubatore per colture cellulari	Kendro	Cella Hera 150
Centrifuga per coltura cellulare	Hettich	Rotofix 32A
Diodo laser	Optotech	Fibra monomodale da 780 nm - accoppiata LD
fibra ottica	Thorlabs	780 CV
Misuratore di potenza	coerente	Controllo laser
ImmagineJ	http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html
Microscopio a epifluorescenza	Strumenti Axon	ImageX-press 5000A
Pbs
Piastra in polistirene a 96 pozzetti
CO2
Palloni T75