Generazione di colture cellulari primarie di ganglio retinico da embrioni di zebrafish

Abstract

Fonte: Terzi, A., et al., ROS Imaging di cellule vive durante lo sviluppo neuronale. J. Vis. Exp. (2021)

Il video dimostra un metodo per coltivare cellule gangliari retiniche primarie da embrioni di pesce zebra. Gli embrioni in fase iniziale vengono sottoposti a dissezione per isolare gli occhi, che vengono successivamente dissociati meccanicamente in una sospensione di cellule gangliari retiniche. Questa sospensione cellulare viene coltivata su vetrini coprioggetti rivestiti con proteine adesive per facilitare lo sviluppo degli assoni.

Protocollo

1. Preparazione delle soluzioni

1. Supporti E2 (1x)
   1. Preparare 100 soluzioni di E2A (500 mL), 500x E2B (100 mL) e 500x E2C (100 mL) combinando tutti i componenti mostrati nella Tabella 1. Soluzioni in autoclave E2A, E2B ed E2C. Conservare a 4 °C.
   2. Per 1 terreno E2: combinare 5 ml di 100x E2A, 1 ml di 500x E2B e 1 ml di 500x E2C. Portare il volume a 500 ml con acqua sterile. Regolare il pH a 7,0-7,5.
   3. Preparare 50 mL di aliquote di 1x terreno E2 e conservare a -20 °C per la conservazione a lungo termine. Tuttavia, al momento dello scongelamento possono verificarsi precipitazioni. Assicurarsi che la precipitazione sia completamente disciolta prima di utilizzare la soluzione madre.

Tabella 1: Componenti di 1x terreno E2 per coltura cellulare di pesce zebra.

soluzione	componente	importo	concentrazione
100X E2A (500 ml)
	NaCl	43,8 g	1500 mM
	Kcl	1,88 g	50 mM
	MgSO4	6 g	100 mM
	KH2PO4	1,03 g	15 mM
	Na2HPO4	0,34 g	5 mM
500X E2B (100 mL)
	CaCl2	5,5 g	500 mM
500X E2C (100 mL)
	NaHCO3	3 g	350 mM
1X E2 (500 mL)
	100X E2A	5 ml	1X
	500X E2B	1 ml	1X
	500X E2C	1 ml	1X

2. E3 Media (1x)
   1. Sciogliere i componenti in 1 L di acqua sterile come mostrato nella Tabella 2 per ottenere 100 volte il brodo. Diluire il brodo in acqua sterile per ottenere 1 terreno E3.
   2. Aggiungere lo 0,2% di blu di metilene. Per 20 mL di terreno 1x E3, aggiungere 40 μL di blu di metilene.

Tabella 2: Componenti di 100x terreni E3 per il mantenimento di embrioni di zebrafish.

componente	Quantità (g)	Concentrazione in stock 100X (mM)
NaCl	29.22	500
Kcl	1.26	17
CaCl2 2H2O	4.85	33
MgSO4 7H2O	8.13	33

3. 80x soluzione madre salina
   1. Combina tutti i componenti mostrati nella Tabella 3. Aggiungere acqua per ottenere 100 ml di soluzione. Mescolare fino a quando tutti i componenti non si saranno sciolti. Conservare la soluzione a 4 °C.

Tabella 3: Componenti della soluzione salina 80x per terreni di coltura cellulare di pesce zebra.

componente	Quantità (g)	Concentrazione in magazzino (mM)
glucosio	1.44	80
Piruvato di sodio	0,44	40
CaCl2 2H2O	0,148	10
HEPES	6.1	256

4. Terreno di coltura cellulare di pesce zebra (ZFCM+)
   1. Combinare tutti i componenti mostrati nella Tabella 4 per ottenere un terreno da 250 mL. Regolare il pH a 7,5. Filtrare i media utilizzando un filtro da 0,22 μm e conservarli a 4 °C.

Tabella 4: Componenti del terreno di coltura cellulare di pesce zebra con siero e antibiotici.

componente	Quantità (mL)	% volume
L-15 medio (con rosso fenolo)	Codice: 212,75	85,1
Siero fetale bovino (FBS)	5	numero arabo
Penicillina/Streptomicina	1	0,4
Soluzione salina 80X	3,125	1.25
Acqua	28.125	Ore 11.25

2. Coltura primaria di cellule gangliari retiniche derivata da embrioni di zebrafish

NOTA: Eseguire i passaggi 2.1 e 2.2 in una cappa a flusso laminare.

1. Preparazione dei vetrini coprioggetto
   1. Prepara 4-6 piastre di coltura in ogni esperimento. Utilizzare vetrini coprioggetti puliti con acido (22 x 22 mm quadrati; 0,16-0,19 mm di spessore) conservati in etanolo al 100%.
   2. Rimuovere un vetrino coprioggetti dal contenitore di stoccaggio utilizzando una pinza e fiammeggiarlo per rimuovere l'etanolo residuo.
   3. Asciugare completamente il vetrino coprioggetti all'aria posizionandolo ad angolo all'interno di una capsula di coltura da 35 mm.
   4. Preparare la soluzione di lavoro di poli-D-lisina (PDL) (1x) diluendo 10x stock (5 mg/mL) in acqua sterile.
   5. Applicare 100 μL di 0,5 mg/mL di PDL al centro di ciascun vetrino coprioggetti ed evitare la diffusione della soluzione sui bordi.
   6. Incubare il PDL su vetrini coprioggetti per 20-30 minuti a temperatura ambiente (RT). Assicurarsi che il PDL non si asciughi.
   7. Lavare il PDL con 0,5 ml di acqua sterile tre volte. Lasciate asciugare completamente i piatti.
   8. Preparare la soluzione di lavoro della laminina (1x) diluendo 50x stock (1 mg/mL) in 1x PBS.
   9. Applicare 100 μL di 20 μg/mL di laminina in PBS al centro di ciascun vetrino coprioggetti ed evitare la diffusione della soluzione ai bordi.
   10. Incubare le piastre a 37 °C in un'incubatrice umidificata per 2-6 ore. Evitare l'essiccazione della soluzione di laminina.
2. RGC per dissezione e piastratura embrionale
   1. Preparare ed etichettare quattro piastre per colture tissutali da 35 mm e riempire con 4 ml di: etanolo al 70%, "terreno E2 1", "terreno E2 2", "terreno E2 3" il giorno della dissezione. Conservare i piatti in frigorifero fino alla dissezione.
   2. Quando gli embrioni di zebrafish sono 34 ore dopo la fecondazione (hpf), estrarre dall'incubatrice le piastre di coltura rivestite di laminina e lavare i vetrini coprioggetti tre volte con 0,5 ml di 1x PBS.
   3. Dopo il lavaggio finale, aggiungere 4 mL di terreno ZFCM(+) a ciascuna piastra di coltura ed evitare di asciugare la piastra.
   4. Recupera i piatti di coltura preparati dal passaggio 2.2.1. Lasciali equilibrare a RT.
   5. Riempire 4-6 provette per PCR con 15 μL di terreno ZFCM(+). È necessaria una provetta per preparare gli RGC da 4 occhielli da placcare su un vetrino coprioggetti.
   6. Recupera gli embrioni di zebrafish dall'incubatrice e immergi gli embrioni in una piastra di coltura tissutale da 35 mm contenente il 70% di etanolo per 5-10 s per sterilizzarli.
   7. Utilizzando una pipetta di trasferimento, trasferire gli embrioni nella piastra E2 Media 1 contenente terreno E2 sterile per lavare l'etanolo in eccesso.
   8. Trasferire gli embrioni nella piastra E2 Media 2 e rimuovere i loro corioni con una pinza affilata.
   9. Trasferire gli embrioni nella piastra finale E2 Media 3 per eseguire le dissezioni.
   10. Usando un paio di pinze sottili, seziona le retine.
   11. Posizionare e tenere gli embrioni anteriormente al loro tuorlo con una delle pinze e rimuovere la coda posteriormente al sacco vitellino con le altre pinze.
   12. Afferra il collo con una pinza e stacca la testa per esporre il cervello e gli occhi ai media E2. Evitare di tagliare il sacco vitellino.
   13. Con la punta di una pinza sottile, fai rotolare delicatamente gli occhi dalla testa, tenendo premuto il tessuto cranico con la seconda pinza. Tenere gli occhi isolati dai detriti di tessuto adiacenti.
   14. Trasferire quattro occhi in una delle provette precedentemente preparate contenenti ZFCM(+).
   15. Titolare delicatamente su e giù con la pipetta P20 e una punta gialla circa 45 volte per dissociare le cellule. Evitare bolle d'aria.
   16. Trasferire lo ZFCM(+) con le celle dissociate al centro del vetrino coprioggetti. Ripetere i passaggi 10-12 per ulteriori vetrini.
   17. Mantenere le colture sul banco di lavoro a 22 °C su un rack di polistirene espanso per assorbire le vibrazioni.
   18. Eseguire l'imaging 6-24 ore dopo la placcatura.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piatto di coltura da 35 mm	Sarstedt	83-3900
Cloruro di calcio diidrato	Fisher Scientifico	C79-500
Vetro di copertura	Corning	2850-22
Piastre di Petri monouso (100 x 15 mm)	VWR	Codice 25384-094
Siero fetale bovino	ThermoFisher Scientifico	26140087
glucosio	Sigma Aldich	G7528
HEPES	Sigma Aldich	H4034
Laminina	ThermoFisher Scientifico	Codice 23017-015
L-15 Medium di Leibovitz senza rosso fenolo	Gibco/Fisher Scientific	Codice 21-083-027
Pbs	Hyclone/Fisher Scientifico	SH3025601
Penicillina/streptomicina	ThermoFisher Scientifico	15140122
Poli-D-lisina (PDL)	Sigma Aldich	P7280
Piruvato di sodio	Sigma Aldich	P5280
Filtro Steritop da 0,22 μm	Millipore	S2GPT05RE