Sono state ottenute approvazioni etiche durante l'esecuzione degli esperimenti.
1. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMNC)
- Assicurarsi che tutti i donatori abbiano firmato il consenso informato prima del prelievo di sangue in conformità con le linee guida istituzionali.
- Prelevare 30 ml di sangue da donatori sani da personale medico addestrato secondo il protocollo standard.
- Isolare i PBMNC mediante mezzi a gradiente di densità. Utilizzare 10 mL di terreno con 25 mL di sangue 1:1 diluito con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e centrifugare a 300 x g per 30 min.
- Isolare lo strato di interfase tra il plasma e il mezzo di gradiente di densità mediante pipettaggio. Lavare le cellule isolate con 5 mL di PBS sterile e centrifugare a 300 x g per 10 min. Ripetere due volte.
- Contare il numero di cellule con metodi standard utilizzando una camera di conteggio.
2. Attivazione della glicoproteina ancorata al glicosilfosfatidilinositolo umano (GPI) mediante reticolazione di anticorpi sulla superficie delle PBMNC
- Posizionare le 6 x 106 cellule mononucleate (MNC) in provette da 15 mL ed eseguire la reticolazione degli anticorpi incubando le cellule con un anticorpo specifico per la proteina di membrana legato a GPI umano (30 μg/mL) per 30 minuti in PBS con albumina sierica bovina (BSA) all'1% a 37 °C.
- Sostituire il terreno di incubazione con il terreno di Dulbecco modificato di Iscove integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Far crescere le cellule in provette di polistirene da 15 mL, mettere le provette in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 8-10 giorni (senza agitare). Il giorno 5 (D5), aggiungere altri 1-2 ml di terreno di Iscove integrato con il 10% di FBS a ciascuna provetta da 15 ml.
3. Ordinamento delle celle dedifferenziate appena generate
- Contare le cellule con un contatore di cellule automatizzato (18 μL di sospensione cellulare + 2 μL di colorante a fluorescenza) o in una camera di conteggio.
- Centrifugare la sospensione cellulare in coltura (5-7 x 106) a 300 x g per 10 minuti e aspirare il surnatante risultante con una pipetta sterile Pasteur.
- Risospendere il pellet cellulare in 90 μl di PBS pre-raffreddato pH 7,2, 0,5% BSA e 2 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA).
- Aggiungere microsfere magnetiche CD45 positive di dimensioni nanometriche (80 μL) alla sospensione cellulare e incubare su ghiaccio per 15 minuti.
- Lavare le cellule aggiungendo 2 mL di tampone PBS e centrifugare a 300 x g per 10 minuti.
- Risospendere le cellule in 500 μL di tampone PBS.
- Lavare la colonna con 500 μL di tampone PBS pre-raffreddato e posizionarla nel campo magnetico.
- Posizionare la sospensione cellulare sulla colonna e lavarla con 500 μL di tampone PBS (due volte) e il flusso della centrifuga contenente cellule CD45 negative. Raccoglili nel terreno di Iscove integrato con l'1% di BSA.
- Contare le celle nella camera di conteggio.
4. Preparazione di piastre di coltura cellulare per la differenziazione neuronale di cellule staminali appena generate
- Rivestire i recipienti di coltura con poli-L-ornitina e laminina per la crescita delle cellule neuronali.
- Collocare i vetrini coprioggetti in piastre a 4 pozzetti e rivestirli con poli-L-ornitina diluita 1:5 (0,1 mg/mL in acqua distillata doppia [ddH2O]) in ddH2O. Collocare i vetrini coprioggetti in un incubatore a 37 °C per 1 ora. Quindi lavare con ddH2O.
- Scongelare lentamente la laminina (0,5-2,0 mg/mL) e aggiungere sulla parte superiore dei vetrini. Incubarlo a 37 °C per 2 ore.
- Preparare il terreno di induzione neurale N2 costituito da 49 mL di miscela F-12 (D-MEM/F12) modificata di Eagle di Dulbecco, 500 μL di integratore di N2, 400 μL di aminoacidi non essenziali (NEAA), soluzione di fattore di crescita basico dei fibroblasti (FGF) alla concentrazione finale di 20 ng/mL (preparata da 100 μg/mL di soluzione madre) ed eparina alla concentrazione finale di 2 ng/mL.
- Rimuovere la laminina in eccesso mediante pipettaggio e aggiungere il terreno neuronale N2 ai piatti di coltura.
5. Coltura di cellule del sangue neuronali dedifferenziate
- Coltura di cellule CD45 negative derivate da BD su vetrini rivestiti di laminina/ornitina per 2 giorni in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 in terreno N2 per avviare una differenziazione neuronale di cellule appena generate da BD.
- Colture di cellule ulteriormente in terreno di differenziazione neuronale costituite da 48 mL di terreno neurobasale, 500 μL di L-glutammina, 1 mL di integratore B27, 500 μL di NEAA, 50 μL di fattore neurotrofico derivato dalla glia umana ricombinante (GDNF) a 5 μg/250 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di fattore neurotrofico derivato dal cervello umano ricombinante (BDNF) a 5 μg/200 μL in PBS/0,1% BSA e 50 μL di soluzione di acido ascorbico 2,9 g/50 mL in PBS. Porre le piastre in un'incubatrice a 37 °C e 5% di CO2.
