1. Assorbimento di nanoparticelle magnetiche cellulari (MNP)
- Preparare il terreno di crescita di base per la coltura cellulare PC12 aggiungendo il 10% di siero di cavallo (HS), il 5% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina/streptomicina e lo 0,2% di amfotericina al terreno del Roswell Park Medical Institute (RPMI) e filtrare utilizzando un filtro di nylon da 0,22 μm.
- Aggiungere l'1% di siero di cavallo (HS), l'1% di L-glutammina, l'1% di penicillina/streptomicina e lo 0,2% di amfotericina al terreno RPMI per preparare il terreno di differenziazione PC12 e filtrare utilizzando un filtro di nylon da 0,22 μm.
- Far crescere le cellule in un pallone di coltura non trattato con 10 mL di terreno di crescita basico; aggiungere 10 mL di terreno di crescita basico al pallone ogni 2-3 giorni e sotto-coltivare le cellule dopo 8 giorni.
- Per l'assorbimento cellulare, centrifugare la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga per 8 minuti a 200 × g a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
- Risospendere le cellule in 3 mL di terreno di crescita basico fresco. Anche in questo caso, centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 × g a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 3 mL di terreno di differenziazione fresco.
- Aspirare le cellule 10 volte usando una siringa e un ago per rompere i gruppi di cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e seminare 10-6 cellule in un normale piatto da 35 mm non rivestito.
- Aggiungere al piatto il volume calcolato della sospensione di MNP e il volume del mezzo di differenziazione per ottenere la concentrazione di MNP e il volume totale desiderati. Mescolare le cellule, gli MNP e il mezzo di differenziazione; incubare la capsula in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2 a 37 °C per 24 ore.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 minuti a 200 × g a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di differenziazione fresco e contare le cellule utilizzando un emocitometro.
2. Differenziazione e crescita cellulare su piattaforma magnetica
- Pulire il substrato modellato con etanolo al 70% v/v/ e posizionare il substrato in una piastra di coltura da 35 mm nella cappa. Posizionare un magnete grande (~1500 Oersted) sotto il substrato modellato per 1 minuto e rimuovere il magnete spostando prima il piatto verso l'alto e lontano dal magnete, quindi estrarre il magnete dal cofano. Accendi la luce ultravioletta per 15 minuti.
- Rivestire il substrato con collagene di tipo 1 diluendo il collagene di tipo 1 (soluzione da coda di topo) 1:50 in etanolo al 30% v/v. Per rivestire un piatto da 35 mm, aggiungere 20 μL di collagene a 1 mL di etanolo al 30%.
- Coprite il piatto con la soluzione e aspettate che tutta la soluzione evapori, lasciando il piatto scoperto per qualche ora. Lavare 3x in sterile 1x PBS; Il vetrino è pronto per la semina cellulare.
- Sospendere le cellule dopo l'assorbimento cellulare di MNP, seminare 105 cellule in un piatto di coltura da 35 mm e aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione. Incubare la coltura in un incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C.
- Dopo 24 ore, aggiungere 1:100 β-NGF murino fresco (concentrazione finale di 50 ng/mL). Rinnovare il mezzo di differenziazione e aggiungere β-NGF murino fresco ogni 2 giorni.
