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1. Preparazione di piastre rivestite di matrice di membrana basale qualificate per cellule staminali embrionali umane (hESC)
- Scongelare lentamente la soluzione di matrice di membrana basale qualificata hESC (vedere la Tabella dei materiali) a 4 °C per almeno 2-3 ore o durante la notte per evitare la formazione di gel.
- Per preparare le piastre rivestite di matrice a membrana basale, diluire la matrice nel Dulbecco's Modified Eagle Medium a freddo con F12 (DMEM+F12) a una concentrazione finale del 2%. Mescolare bene e rivestire ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL della soluzione di matrice diluita.
- Incubare le piastre rivestite di matrice di membrana basale a temperatura ambiente (RT) per almeno 3 ore o a 4 °C durante la notte.
nota: Le piastre con matrice a membrana basale possono essere conservate a 4 °C per 1 settimana prima che la soluzione della matrice venga rimossa e le piastre vengano utilizzate.
2. Adattamento delle hESC di tipo colonica alla coltura di hESC a singola cellula
- Per far passare le colture prive di feeder-free di hESC della colonia di tipo H9 (WA09) coltivate sulla matrice della membrana basale, aspirare il terreno dai pozzetti (Figura 1A).
- Lavare 1 volta con 1 mL di DPBS. Aggiungere 1 mL di soluzione di dispase (1 U/mL) per pozzetto e incubare a 37 °C per 20 min.
- Rimuovere la dispasi, lavare delicatamente le cellule 1 volta con 2 mL di DMEM/F12, rimuovere il terreno e aggiungere 2 mL di DMEM/F12 a ciascuna piastra.
- Staccare delicatamente le colonie pipettandole delicatamente su e giù e trasferirle in una provetta da 15 ml.
- Centrifugare i pellet per 2 minuti a 370 x g e aspirare il terreno.
- Per dissociare i pellet cellulari in singole cellule, aggiungere 2 mL di soluzione di distacco cellulare (concentrazione 1x, vedere la Tabella dei materiali) e incubare a 37 °C per 10 minuti.
- Centrifugare le celle per 2 minuti a 370 x g e rimuovere la soluzione di distacco.
- Aggiungere il terreno ESC umano mTeSR1 fresco e dissociare le cellule in singole cellule mediante pipettaggio delicato su e giù.
- Per adattare le hESC di tipo colonica a una coltura di tipo a singola cellula, piastra circa 1,5-2,0 x 106 hESC in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale in 2 mL di mTeSR1 contenente 10 μM di inibitore ROCK per 24 ore (Figura 1A).
- Dopo 24 ore, sostituire il terreno hESC con mTeSR1 fresco senza inibitore ROCK e lasciare che le hESC crescano come tipo a cellula singola per 3 giorni. Cambia il mezzo ogni giorno.
- Il giorno 4, quando le colture raggiungono quasi il 100% di confluenza, dissociare le cellule in soluzione di distacco, quindi riplaccare come descritto al punto 2.6.
nota: L'inibitore ROCK migliora la sopravvivenza cellulare durante le prime 24 ore di coltura di hESC di tipo a cellula singola.
3. Differenziazione delle hESC di tipo a cellula singola in NPC (Figura 2)
- Per indurre il differenziamento delle NPC, dissociare le hESC di tipo a cellula singola con 1 mL di soluzione di distacco (1x) e incubare per 10 minuti a 37 °C.
- Centrifugare le cellule per 2 minuti a 370 x g e rimuovere la soluzione di distacco surnatante. Aggiungere 1 mL di DMEM/F12 e risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato.
- Piastre su una piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana basale a una densità di 2 x 105 cellule/pozzetto in 2 mL di mTeSR1 contenente 10 μM di inibitore ROCK.
- Dopo 24 ore, sostituire il terreno di coltura con un mezzo di induzione neurale (DMEM con 1% di B27 meno vitamina A) integrato con 1 μM di dorsomorfina e 5 μM di SB431542.
- Cambiare il mezzo a giorni alterni durante i primi 4 giorni di induzione neurale, poi ogni giorno fino a raggiungere la confluenza al giorno 7 (Figura 2B).
NOTA: (1) La dorsomorfina inibisce la via BMP prendendo di mira i recettori ALK2,3,6 e inibisce anche l'AMPK; SB431542 è un inibitore della via TGFβ/Activina prendendo di mira ALK5,7. (2) Lo stesso protocollo è stato testato con un'altra linea ESC (WA01), che ha prodotto risultati simili a WA09. (3) Abbiamo generalmente utilizzato Matrigel per la matrice della membrana basale; tuttavia, le cellule possono essere coltivate su Geltrex e quindi differenziate in NPC con risultati molto simili, come indicato dall'espressione di diversi marcatori NPC (Figura 3D, E). Maneggiare Geltrex nello stesso modo di Matrigel (vedere paragrafo 1).
