Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Sterilizzazione dei materiali
NOTA: Tutto il materiale e le soluzioni devono essere sterilizzati prima dell'uso.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici e il materiale per affettare il vibratomo (portacoltello, disco per campioni, vassoio tampone) in un forno di sterilizzazione a secco per 4 ore a 180 °C.
- Sterilizzare materiali o apparecchiature sensibili alla temperatura mediante irradiazione UV o gamma.
- Sterilizzazione di terreni e soluzioni mediante autoclavazione o filtrazione attraverso membrane con pori da 0,22 μm.
2. Preparazione delle soluzioni
- Preparare 15-20 mL di soluzione di trasporto: 50% v/v di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) pH 7,4, 50% v/v di terreno basale per il mantenimento dei neuroni cerebrali post-natali e adulti (Tabella dei materiali), integrata con 10 mM di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES), 3 mg/mL di glucosio e 33 μg/mL di gentamicina.
nota: La soluzione di trasporto deve essere refrigerata e ossigenata (gorgogliando con gas carbogeno) per almeno 20 minuti prima della raccolta del campione.
- Preparare 300 ml di soluzione per affettare (HBSS integrata con 10 mM di HEPES e 3 mg/mL di glucosio) e raffreddarla in congelatore fino al punto di formazione iniziale dei cristalli.
- Preparare 20 mL di terreno di coltura: terreno basale per il mantenimento dei neuroni cerebrali post-natali e adulti (Tabella dei materiali) integrato con l'1% di derivato della L-glutammina (Tabella dei materiali), 2% di integratore per la coltura neurale (Tabella dei materiali), penicillina/streptomicina all'1% e 0,25 μg/mL di amfotericina B.
3. Impostazione dell'apparato per affettare
NOTA: Questo protocollo viene eseguito idealmente con l'assistenza di un collega a causa della logistica della raccolta dei campioni in sala operatoria.
- In un secchio di ghiaccio con aggiunta di sale, lasciare riposare la soluzione per affettare sotto la bollenza della miscela di carbogeno (95% O2, 5% CO2) per almeno 20 minuti prima dell'uso.
- Preparare un blocco di agarosio al 3% (circa 2 cm x 2 cm x 2 cm) e incollarlo al disco del campione di vibratomo per creare un ulteriore supporto meccanico al campione di tessuto durante l'affettatura (Figura 1E).
- Impostare il vibratomo per l'affettatura: spessore della sezione di 200 μm, frequenza di vibrazione di 100 Hz e velocità di affettatura tra 0,5-1,0 mm/s.
- Bloccare il vassoio del tampone del vibratomo alla base del vibratomo e aggiungere ghiaccio per mantenerlo in frigorifero prima di ricevere la soluzione di affettatura e il campione e durante la procedura di affettatura.
4. Raccolta campioni
NOTA: In questo protocollo, il tessuto neocorticale umano è stato raccolto in sala chirurgica e trasportato in laboratorio.
ATTENZIONE: Quando si tratta di campioni umani, seguire gli appropriati protocolli di sicurezza stabiliti dall'Istituzione.
- Installare l'apparato di trasporto (Figura 1C) che consiste in: una bombola di gas portatile con miscela di carbogeno collegata a una valvola di pressione/flusso che controlla l'uscita del gas collegata a un tubo di silicone che collega l'uscita del gas al recipiente di trasporto; un recipiente di trasporto, solitamente una provetta da centrifuga conica da 50 mL con coperchio perforato per l'ingresso del gas, contenente la soluzione di trasporto; e ghiaccio per il raffreddamento del campione durante il trasporto.
- Raccogliere e trasportare immediatamente il campione (Figura 1B) in laboratorio. Immergere il campione in una soluzione di trasporto a freddo (costantemente gorgogliata con una miscela di carbogena).
5. Affettare
- Trasferire il campione in una piastra di Petri (100 mm x 20 mm) contenente una soluzione di affettamento e, con strumenti chirurgici fini, rimuovere con cura il più possibile le meningi rimanenti nel campione (Figura 1D).
- Scegliere il miglior orientamento del provino per la produzione di fette con le particolari caratteristiche del disegno sperimentale, e con una lama di bisturi n. 24, rifilare una superficie piana come base incollata al disco del campione.
- Utilizzando un cucchiaio di plastica usa e getta e pennelli delicati, raccogliere il frammento dalla capsula di Petri e asciugare la soluzione in eccesso utilizzando carta da filtro (asciugare per capillarità ed evitare di toccare il frammento di tessuto con la carta).
- Usando la supercolla, attaccare il tessuto al disco del campione del vibratomo fino a quando non aderisce saldamente al disco e viene a contatto con il blocco di agarosio (Figura 1E).
- Posizionare il disco del campione del vibratomo (con il tessuto correttamente attaccato) nel vassoio del tampone del vibratomo riempito con la soluzione di affettatura che deve gorgogliare durante l'intero processo.
- Bloccare il portacoltello in posizione con la lama del rasoio saldamente fissata.
- La soluzione di affettatura deve coprire sia il campione che la lama, solo allora iniziare ad affettare (Figura 1F).
- Tagliare il campione in fette da 200 μm.
nota: Sebbene alcuni vibratomi tagliano automaticamente i campioni, l'osservazione ravvicinata e piccole regolazioni della velocità di taglio durante il processo possono aiutare a produrre fette migliori. Scartare le fette irregolari iniziali.
- Trasferire le fette dal vassoio del tampone in una capsula di Petri con la soluzione per affettare e tagliare i bordi sciolti e la materia bianca in eccesso in una proporzione di circa il 70% di corteccia/30% di sostanza bianca.
6. Cultura
NOTA: Esegui questo passaggio in una cappa a flusso laminare in ambiente sterile.
- Aggiungere 600 μl di terreno di coltura per pozzetto (in una piastra da 24 pozzetti) e incubare per almeno 20 minuti a 36 °C e 5% di CO2 prima di galvanizzare le fette.
- Impiattare una fetta per pozzetto usando un pennello (Figura 1G).
- Se nella piastra sono presenti pozzetti inutilizzati, riempirli con 400 μL di acqua sterile.
- Incubare la piastra a 36 °C, 5% CO2,
nota: La prima sostituzione del mezzo deve essere effettuata tra le 8 e le 16 ore dopo la placcatura, a seconda delle dimensioni della fetta.
- Integrare 10 mL del terreno di coltura precedentemente preparato con 50 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF).
nota: Durante le prime 8-16 ore, le fette vengono incubate in 600 μL di terreno per evitare la privazione di nutrienti e l'acidificazione, poiché il consumo di terreno in questa fase è accelerato. Dalla fase successiva, il volume del terreno per pozzetto viene regolato a 400 μL.
- Rimuovere 333 μl del terreno condizionato da ciascun pozzetto e aggiungere 133 μl di terreno fresco integrato con BDNF.
- Ripetere il processo di sostituzione del terreno ogni 24 ore sostituendo un terzo del terreno condizionato con un terreno fresco integrato con BDNF.
