Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Prepara una capsula di Petri per l'immunopanning CD11b (Giorno 0)
NOTA: Prepara 1 piatto di immunopanning per ogni 1 - 2 cervelli di ratto giovane.
- Aggiungere 25 mL di soluzione 50 mM Tris pH 9.5 in una piastra di Petri da 15 cm.
- Aggiungere le IgG anti-topo di capra (catene H+L) alla piastra per una concentrazione finale di 6 μg/mL. Ruotare la piastra per distribuirla uniformemente.
- Incubare la capsula per 1 - 3 ore a 37 °C.
- Sciacquare le stoviglie tre volte con DPBS++ (soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Ca2+ e Mg2+), quindi sostituire con una soluzione di tampone di panning contenente 1 μg/mL di anticorpo OX42. Lasciare i piatti per una notte a temperatura ambiente su una superficie piana.
2. Raccolta dei tessuti (giorno 1)
NOTA: Questo protocollo dovrebbe richiedere ~3 - 4 ore.
- Prima di iniziare, assicurarsi che tutte le soluzioni siano sterili e raffreddate con ghiaccio. Raffreddare tutti gli strumenti con ghiaccio e sterilizzarli con etanolo prima dell'uso.
- Seguendo le procedure normative appropriate, sacrificare un giovane ratto da laboratorio per asfissia da anidride carbonica><.
nota: In alternativa, gli animali più giovani possono essere sacrificati con una dose letale di ketamina/xilazina (100 - 200 μL di ketamina 24 mg/mL, xilazina 2,4 mg/mL). La ketamina/xilazina deve essere utilizzata se gli animali hanno meno di 14 giorni di età. Se si utilizzano più animali, estrarre il tessuto da un animale e metterlo in DPBS++ pre-raffreddato su ghiaccio prima di procedere con gli animali successivi.
- Pizzica una zampa posteriore e assicurati che l'animale non risponda completamente prima di procedere.
- Perfondere transcardicamente l'animale con 10-30 mL di tampone di perfusione ghiacciato utilizzando un ago da 271/2-G fino a quando il tampone non diventa limpido.
nota: Il volume del tampone di perfusione varia a seconda delle dimensioni/età dell'animale.
- Immediatamente dopo la perfusione rimuovere la testa dell'animale. Uscendo dal midollo spinale tagliare il condilo occipitale su ciascun lato con le forbici da dissezione, fare attenzione a non danneggiare il cervello. Dopo aver tagliato con cura ogni lato, tagliare un lato lungo l'osso parietale e frontale verso l'osso nasale. Con una pinza tirare indietro con cautela la parte superiore del cranio, rimuovere rapidamente il cervello (o le strutture del SNC di interesse) e posizionarlo in DPBS++ pre-raffreddato su ghiaccio.
- Ripetere per tutti gli animali rimanenti.
nota: Tutte le fasi successive devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare in condizioni sterili adeguate.
3. Dissociazione meccanica (giorno 1)
- Dopo che tutti i cervelli sono stati raccolti, tagliare un cervello in 3 pezzi di 1 mm in una capsula di Petri su ghiaccio con una lama di bisturi fredda e trasferirlo in un omogeneizzatore dounce ghiacciato con 5 - 7 ml di tampone duncing ghiacciato. Dissociare un cervello alla volta.
- Dissociare il tessuto con 10 - 20 passaggi delicati e incompleti con un omogeneizzatore a balza largo. Fare attenzione a non schiacciare direttamente il fazzoletto sul fondo dell'omogeneizzatore, ma a spingere il fazzoletto attraverso lo spazio tra i lati del pistone e dell'omogeneizzatore.
- Rimuovere con cautela il pistone per evitare l'introduzione di bolle d'aria. Lasciare che i pezzi di tessuto scarsamente dissociati si depositino sul fondo dell'omogeneizzatore e trasferire il surnatante in una nuova provetta conica refrigerata da 50 mL.
- Sostituire il volume rimosso con un tampone douncing fresco e ripetere i passaggi 3.2 e 3.3 per un totale di 3 - 4 cicli, o fino a quando tutto il tessuto non è stato dissociato. Ripeti la procedura per ogni cervello.
4. Rimozione della mielina (giorno 1)
NOTA: La rimozione della mielina viene utilizzata per l'isolamento della microglia da animali di età superiore a P12.
- Misurare il volume della sospensione cellulare nella provetta conica da 50 mL utilizzando una pipetta da 25 mL, quindi aggiungere un tampone douncing ghiacciato per regolare il volume totale a 33,5 mL.
- Aggiungere 10 mL di tampone di separazione mielinica (MSB) alla sospensione cellulare e mescolare accuratamente capovolgendo la provetta più volte. Ciò si tradurrà in una concentrazione finale del 23% di MSB in un volume di 43,5 ml.
- Centrifugare le celle per 15 min a 500 x g a 4 °C con frenatura lenta.
nota: La centrifuga dovrebbe impiegare circa 1,5 - 2 minuti per decelerare. Questo genererà uno strato superiore di mielina e detriti di cellule morte, un surnatante un po' torbido e un pellet più piccolo che viene arricchito per le cellule vive.
- Rimuovere lo strato superiore di mielina/detriti e il surnatante con una pipetta. Fare attenzione quando si rimuove lo strato superiore per assicurarsi che venga rimosso il più possibile.
- Risospendere il pellet di cella in 12 mL di tampone di panning. Triturare delicatamente la sospensione cellulare per rompere eventuali grumi di cellule che potrebbero rimanere.
5. Immunopanning (Giorno 1)
- Far passare la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm per rimuovere detriti di grandi dimensioni o grumi di cellule.
- Sciacquare tre volte la pirofila rivestita in OX42 con DPBS++. Non lasciare che la piastra si asciughi completamente tra un lavaggio e l'altro.
- Versare l'ultimo lavaggio DPBS++ e applicare la sospensione cellulare filtrata sulla pirofila. Agitare delicatamente la piastra per distribuire le cellule, quindi incubare la piastra su una superficie piana a temperatura ambiente per 20 minuti per consentire alle cellule di aderire. Non incubare per più di 20 minuti o le cellule diventeranno molto difficili da recuperare dalla piastra.
- Sciacquare la pirofila con DPBS++ 10 volte per rimuovere le cellule non aderenti. La microglia sarà saldamente attaccata alla piastra, quindi agitare la piastra ad ogni risciacquo per garantire la rimozione di altre cellule non aderenti.
- Versare l'ultimo lavaggio DPBS++ e sostituirlo con 15 mL di DPBS++ e 200 μL di tripsina (soluzione madre all'1,25%).
- Incubare la capsula per ≤10 minuti a 37 °C con il 10% di CO2 per tripsinizzizzare.
nota: Non continuare per più di 10 minuti o la microglia diventerà difficile da rimuovere.
- Dopo 10 minuti di tripsinizzazione, la microglia sarà ancora attaccata alla piastra. Versare la tripsina/DPBS++ e lavare delicatamente 2 volte con DPBS++ per rimuovere la tripsina, sostituire con 12 ml di terreno di coltura della microglia ghiacciato (MGM).
- Metti la pirofila sul ghiaccio per 2 minuti per indebolire l'interazione cellula/substrato e assicurati che la pirofila sia piatta per evitare che le aree della pirofila si secchino.
- Pipettare energicamente con una pipetta da 10 ml e un controller per pipette ad alta velocità per recuperare le cellule dal piatto di cottura. Disegnare una griglia 16 x 16 con il flusso di liquido dalla pipetta per cercare di rimuovere tutte le cellule.
- Controllare le cellule al microscopio con un ingrandimento 20X per assicurarsi che le cellule si siano staccate dalla piastra. Segnare i punti sulla parte superiore della piastra in cui le cellule sono ancora bloccate e ripetere il pipettaggio in quelle aree.
- Raccogliere la sospensione cellulare e aliquotare 3 - 4 mL di surnatante per provetta conica da 15 mL. Centrifugare per 15 minuti a 500 x g a 4 °C con frenata lenta.
nota: La rotazione della microglia attraverso un piccolo volume consente il massimo recupero delle cellule.
- Aspirare il surnatante, lasciando 0,5 mL di MGM con il pellet cellulare.
- Risospendere ogni pellet nell'MGM rimanente e riunire le celle da tutte le provette.
- Contare le cellule con l'emocitometro.
- Piastre di celle come descritto nei passaggi 6 - 7 a seconda dell'applicazione.
- Colture cellulari a 37 °C con 10% di CO2,
nota: Le cellule possono essere coltivate per un massimo di 3-4 settimane con cambi di terreno regolari o una settimana senza cambi di terreno.
6. Piastre per coltura tissutale/vetrini coprioggetti con rivestimento spot (giorno 1)
- Piastra 15 μL di rivestimento di collagene IV direttamente al centro di una piastra di coltura tissutale rivestita anionica/cationica a 24 pozzetti (vedere la Tabella dei materiali per i dettagli) e incubare per 15 minuti a 37 °C con il 10% di CO2.
- Dopo aver contato le cellule con l'emocitometro, diluire le cellule a 2,3 x 105/mL in MGM. Aspirare il punto di collagene IV e preparare immediatamente 15 μL di sospensione cellulare in questo punto; Questo darà 3,5 x 103 cellule/punto. Incubare per 5 - 10 minuti a 37 °C con il 10% di CO2 per consentire alle cellule di aderire, aggiungere delicatamente 500 μL di TGF-β2/IL-34/colesterolo bilanciato con CO2 e terreno di crescita (TIC) al pozzetto.