Preparazione di sezioni cerebrali utilizzando un metodo di recupero protettivo basato su NMDG

In questo articolo

Abstract

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Fonte: Ting, J. T. et al. Preparazione di fette acute di cervello utilizzando un metodo di recupero protettivo ottimizzato per la N-metil-D-glucamina. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video descrive un protocollo per ottenere fette di cervello utilizzando un metodo di recupero protettivo basato su N-metil-D-glucamina (NMDG). Un cervello sezionato viene incubato in un aCSF con NMDG e HEPES per ridurre al minimo la morte e il danno delle cellule neuronali durante il sezionamento. La sezione può essere recuperata nell'aCSF per ripristinare le attività cellulari

Protocollo

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1. Dissezione e Affettatura del Cervello

Decapita l'animale. Usa un bisturi per aprire la pelle sulla testa ed esporre la calotta cranica.
Usa le forbici a taglio super fine per tagliare via la pelle sopra la calotta cranica e fai piccole incisioni lateralmente su entrambi i lati alla base caudale/ventrale del cranio. Eseguire ulteriori tagli superficiali a partire dalla parte caudale/dorsale del cranio, spostandosi in direzione rostrale lungo la linea mediana dorsale facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante. Effettuare un taglio finale a "T" perpendicolare alla linea mediana a livello dei bulbi olfattivi.
nota: È necessario prestare attenzione per garantire che non vengano arrecati danni alle regioni cerebrali di interesse. In particolare, in nessun momento dovrebbe essere applicata alcuna forza di compressione al cervello stesso.
Usa la pinza a punta tonda per afferrare il cranio, iniziando dall'aspetto rostrale-mediale e staccando verso la direzione caudale-laterale. Ripeti per entrambi i lati per aprirsi e rimuovere le metà dorsali della calotta cranica per esporre il cervello. Estrarre delicatamente il cervello intatto nel becher di NMDG-HEPES aCSF pre-raffreddato. Lasciare raffreddare uniformemente il cervello per ~1 min.
Usa la spatola grande per sollevare il cervello dal becher e metterlo sulla capsula di Petri ricoperta di carta da filtro. Taglia e blocca il cervello in base all'angolo di taglio preferito e alla regione cerebrale di interesse desiderata. Lavorare rapidamente per evitare una prolungata privazione di ossigeno durante la manipolazione.
nota: Sono possibili molti angoli di taglio. L'esatto metodo di blocco e l'angolo di taglio dipenderanno dall'esatta regione del cervello, dal tipo di cellula e dal circuito da studiare.
Fissare il blocco cerebrale al portacampioni utilizzando la colla adesiva. Ritrarre la parte interna del supporto del campione quanto basta per estrarre completamente il blocco cerebrale all'interno. Versare l'agarosio fuso direttamente nel supporto fino a quando il blocco cerebrale non è completamente ricoperto di agarosio. Bloccare il blocco di raffreddamento accessorio pre-raffreddato attorno al portacampioni per ~10 s fino a quando l'agarosio non si è solidificato.
Inserire il portacampioni nell'apposito recipiente dell'affettatrice e verificare il corretto allineamento. Riempire il serbatoio con il rimanente NMDG-HEPES aCSF ossigenato e pre-raffreddato dal becher da 250 ml e spostare una pietra a bolle nel serbatoio per tutta la durata dell'affettatura per garantire un'adeguata ossigenazione.
Regolare il micrometro per iniziare a far avanzare il campione cerebrale incluso nell'agarosio. Avviare l'affettatrice e regolare empiricamente la velocità di avanzamento e la frequenza di oscillazione al livello desiderato.
nota: Entrambe le impostazioni dovrebbero essere nella gamma bassa. Per ottenere i migliori risultati, un singolo passaggio del braccio della lama dovrebbe richiedere circa 20 s e l'oscillazione dovrebbe produrre un ronzio molto regolare e delicato senza ronzio evidente.
Continuare ad avanzare e affettare il tessuto con incrementi di 300 μm (o altro spessore preferito) fino a quando la regione cerebrale di interesse non è completamente sezionata; il tempo totale per la procedura di affettatura dovrebbe essere inferiore a 15 minuti.

2. Procedura di recupero protettivo NMDG ottimizzata

Fase iniziale di recupero NMDG (fase critica): Al termine della procedura di sezionamento, raccogliere tutte le fette utilizzando una pipetta Pasteur di plastica tagliata e trasferirle in una camera di recupero iniziale preriscaldata (34 °C) riempita con 150 mL di NMDG-HEPES aCSF. Trasferire tutte le fette in breve successione e avviare un timer non appena tutte le fette vengono spostate nella camera di recupero.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome

Azienda

Numero di catalogo

Commenti

Compresstomo VF-200

Strumenti di precisione

VF-200

Affetta tessuti vibrante (consigliata)

N-metil-D-glucamina

Sigma Aldrich

M2004

Costituente aCSF

cloruro di sodio

Sigma Aldrich

S3014

Costituente aCSF

cloruro di potassio

Sigma Aldrich

P5405

Costituente aCSF

Sodio Fosfato monobasico diidrato

Sigma Aldrich

Codice: 71505

Costituente aCSF

bicarbonato di sodio

Sigma Aldrich

Episodio 5761

Costituente aCSF

HEPES

Sigma Aldrich

H4034

Costituente aCSF

glucosio

Sigma Aldrich

G7021

Costituente aCSF

Ascorbato di sodio

Sigma Aldrich

Codice: A4034

Costituente aCSF

tiourea

Sigma Aldrich

T8656

Costituente aCSF

Piruvato di sodio

Sigma Aldrich

P5280

Costituente aCSF

Cloruro di calcio diidrato

Sigma Aldrich

Visualizzazione del materiale C7902

Costituente aCSF

Solfato di magnesio eptaidrato

Sigma Aldrich

Motore M1880

Costituente aCSF

Pinze smussate curve

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