Una tecnica per l'incubazione prolungata del tessuto neuronale della retina

Abstract

Fonte: Cameron, M. A., et al. Incubazione prolungata di tessuto neuronale acuto per elettrofisiologia e imaging del calcio. J. Vis. Exp. (2017).

Questo video dimostra un metodo per l'incubazione prolungata del tessuto neuronale della retina. Le conchiglie oculari contenenti retina sono ottenute da un occhio di topo; la membrana limitante interna (ILM) viene digerita enzimaticamente per esporre le cellule neuronali della retina e l'oculare trattato o la retina isolata vengono trasferiti in un incubatore specializzato per un'incubazione prolungata a bassa temperatura.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione dell'intero montaggio retinico e rimozione della membrana limitante interna

1. Preparare i supporti interi retinici in condizioni di normale illuminazione di laboratorio o in condizioni di luce rossa/infrarossa fioca.
2. Eutanasia animale mediante lussazione cervicale ed enucleare immediatamente gli occhi. Fare un piccolo taglio lungo l'ora serrata e metterlo in Ames media o nel liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente (mM): 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 3 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 10 glucosio, 0,5 L-glutammina e saturare con carbogeno (miscela 95% O₂/5% CO₂; ~300 mOsm; pH 7,4), a temperatura ambiente (RT).
3. Rimuovere immediatamente la cornea, il cristallino e il vitreo tagliando lungo l'ora serrata con delle forbicine e rimuovendo il cristallino e il vitreo con una pinza. Posizionare il tessuto nel sistema di incubazione a RT.
   nota: Il tessuto retinico può essere mantenuto nell'oculare, dopo una lenta riduzione della temperatura a 15 - 16 °C, per >24 ore nel sistema di incubazione fino al momento del bisogno.
4. Per rimuovere l'ILM, trasferire l'oculare contenente la retina in un piccolo barattolo di vetro contenente 30 U/mL di papaina, 1 mM di L-cistina, 0,5 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 0,005% di desossiribonucleasi (DNasi) nella soluzione salina bilanciata di Earl (BSS) a 37 °C per 20 minuti. Applicare il 95% di O₂/5% di CO₂ nella soluzione attraverso il coperchio, ma non far bollire. Se si utilizza tessuto di animali giovani (<6 settimane), diluire la soluzione a metà forza.
   1. Interrompere la digestione enzimatica mettendo il tessuto in una soluzione di ovomucoide (10 mg/mL) e albumina sierica bovina (BSA, 10 mg/mL) per 10 minuti in Earl's BSS. Lavare accuratamente il tessuto con aCSF prima di trasferirlo nel sistema di incubazione e ridurre la temperatura a 15 - 16 °C.
5. Mantenere il tessuto retinico nell'oculare fino al momento del bisogno. Per il trasferimento al microscopio, isolare la retina dall'oculare e tagliarla in 4 pezzi con una lametta. Se è necessaria l'intera retina, fai quattro piccoli tagli nella periferia della retina per consentirle di rimanere piatta.
   nota: Per gli esperimenti di imaging, caricare con coloranti di calcio prima del trasferimento al sistema di incubazione, vedere di seguito.

2. Mantenimento del tessuto nell'incubatrice

1. Posizionare il tessuto nella camera principale contenente le sonde per le misure di pH e temperatura (Figura 1A, B).
2. Far circolare l'aCSF attraverso una seconda camera (camera UVC, costruita come descritto in precedenza) isolata dalla camera principale ed esposta a luce ultravioletta C (UVC) da 1,1 W (254 nm, lampada UV sterilizzatrice 5W/2P) per eliminare i batteri che galleggiano nella soluzione (Figura 1A). Controlla la temporizzazione della luce UVC tramite un timer programmabile utilizzando una funzione casuale che si accende a orari variabili tra 15 e 26 minuti ogni 15 - 30 minuti per evitare un riscaldamento eccessivo dell'aCSF.
3. Impostare la velocità di flusso nella camera UVC a 12 mL/min come precedentemente riportato. Coprire la camera UVC con un foglio di alluminio per evitare l'illuminazione UVC all'esterno della camera, che può danneggiare il tessuto neuronale.
   nota: Per il tessuto retinico adattato al buio, applicare una copertura su misura sulla camera principale per escludere la luce.
4. Utilizzare una pompa peristaltica per far circolare la soluzione (aCSF) attraverso le due camere e un raffreddatore termoelettrico a piastre fredde Peltier per raffreddare o riscaldare la camera principale alle temperature desiderate nell'intervallo 0 - 50 °C. Per un'incubazione ottimale dei tessuti, utilizzare 15 - 16 °C per una vitalità a lungo termine.

Risultati

Figura 1. Un sistema di incubazione che consente una stretta regolazione dell'ambiente tissutale. A, Diagramma schematico del sistema di incubazione composto da una piastra di Peltier di raffreddamento, una camera principale, una pompa peristaltica e una camera UVC. B, Vista laterale della camera principale che mostra i punti di ingresso e di uscita dell'aCSF, nonché l'ingresso del c...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
cloruro di sodio	Sigma Aldrich VETEC	V800372
cloruro di potassio	Sigma Aldrich	P9333
N-metil-D-glucamina	Sigma Aldrich	M2004
D-glucosio	Sigma Aldrich	G5767
bicarbonato di sodio	Sigma Aldrich	S6014
cloruro di magnesio	Sigma Aldrich	Codice: M9272
cloruro di calcio	Sigma Aldrich	223506
Sistema di dissociazione della papaina	Worthington	LK003150
Microscopio verticale a tavolino fisso	Olimpo	BX51WI
Obiettivo per microscopio	Olimpo	XLUMPlanFLN 20x/1.00w	20 volte
Obiettivo per microscopio	Olimpo	LUMPlanFLN 60x/1.00w	60 volte
Braincubatore	Payo Scientific	BR26021976	www.braincubator.com.au
Peltier-Raffreddatore termoelettrico a piastre fredde	Tecnologia TE	CP-121
Regolatore di temperatura	Tecnologia TE	TC-36-25 RS232