1. Preparazione dei materiali e terreno di coltura
- Per la dissezione e la dissociazione della SCZ (zona sottocallosa), avvolgere la matrice cerebrale, la lama del rasoio a doppio taglio e la pinza con un foglio di alluminio, quindi sterilizzarli in autoclave.
- Preparare 50 ml di tampone PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) freddo per lavare l'intero cervello del topo.
- Installare un microscopio da dissezione e preparare gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione del cervello (forbici e pinze autoclavate) e l'isolamento della SCZ (siringa da 1 ml, ago da 30 G, matrice cerebrale e pinza fine).
- Preparazione di N2 Medium:
- Preparare un terreno F-12/DMEM (+L-glutammina, +bicarbonato di sodio) con il 2% di B27, l'1% di integratori di N2 e l'1% di penicillina-streptomicina.
Nota: Il terreno di crescita è costituito da terreno N2 e fattori di crescita (20 ng/mL di fattore di crescita epidermico purificato (EGF) e 20 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF2)).
- Preparare un tampone per la digestione (40 unità/ml di papaina, 2,4 unità/ml di dispasi II e 2% di penicillina-streptomicina nella PBS) per la digestione dei tessuti.
- Preparazione della piastra di rivestimento e del vetrino coprioggetti:
- Preparare la poli-L-ornitina (PLO; 0,01%) e la laminina (10 μg/ml disciolti in DH2O). Per rivestire piastre a 6 pozzetti per il mantenimento di SCZ-aNSC (cellule staminali neurali adulte) come monostrato o vetrini coprioggetti da 18 mm per l'immunocolorazione, incubarle con PLO per una notte a 4°C. Quindi lavarli 3 volte con DH2O. Lasciare asciugare le piastre e i vetrini coprioggetti dopo l'ultimo lavaggio.
- Successivamente, incubare le piastre con laminina per una notte a 4 °C. Quindi, lavarli 3 volte con DH2O.
Attenzione: Non asciugare la laminina, che influirà sull'attacco delle celle.
Nota: le soluzioni di rivestimento possono essere riutilizzate 3 volte.
2. Isolamento e dissociazione dell'adulto SCZ
- Prima della preparazione della coltura, posizionare la matrice cerebrale e il rasoio a doppio taglio sul ghiaccio.
Nota: non congelare la matrice cerebrale, perché il cervello potrebbe attaccarsi ad essa.
- Sacrificare un topo (8 settimane) per asfissia da CO2 o lussazione cervicale.
- Tagliare la testa con forbici affilate dopo aver spruzzato etanolo al 70%. Per immobilizzare la testa, tenere saldamente entrambi i lati della testa. Tagliare la pelle con le forbici sulla linea mediana in direzione caudale-rostrale. Questo favorisce la completa rimozione della pelle dal cranio.
- Rimuovere prima la parte caudale del cranio (posteriore alla lambda), quindi inserire la pinza tra il cranio e il cervello nella posizione della linea mediana dorsale. Afferra l'osso parietale sinistro (o destro) e staccalo con cura. Ripetere questa procedura per la rimozione dell'altro osso parietale.
Nota: la disconnessione del nervo ottico e la rimozione delle meningi dal cervello facilitano il distacco del cervello dal cranio.
- Trasferire il cervello in un tampone PBS freddo (25 ml) e sciacquarlo due volte per rimuovere il sangue in eccesso.
- Posizionare il cervello nella matrice cerebrale su ghiaccio e fare dei tagli coronali per ottenere fette spesse 1 mm. Trasferire le fette di cervello (1 mm) contenenti le regioni SCZ che si trovano nella parte posteriore del cervello in un PBS freddo in una capsula di Petri di plastica da 35 mm.
cautela: Per ottenere un piano parallelo di sezioni coronali, assicurarsi che la fessura cerebrale sia posizionata nella linea mediana della matrice cerebrale; È fondamentale evitare variazioni non necessarie nelle sezioni.
nota: Ottenere fette di cervello a 2-3 mm posteriormente alla bregma; questo permette la separazione della SCZ dalla SVZ (zona subventricolare).
- Sotto il microscopio da dissezione a basso ingrandimento, sezionare micro-l'SCZ dall'area della sostanza bianca della corteccia e dell'ippocampo con un ago piegato da 30G6,9. Quindi, rimuovere le regioni della corteccia sopra l'SCZ. Posizionare la regione SCZ sezionata dalle fette in una capsula di Petri di plastica da 35 mm su ghiaccio senza PBS.
nota: La contaminazione di regioni extra contenenti neuroni maturi potrebbe influenzare la vitalità delle aNSC e la formazione di neurosfere perché subiscono la morte cellulare in condizioni di coltura di aNSC.
- Utilizzando un ago piegato da 30 G, tagliare immediatamente i tessuti sezionati in piccoli pezzi.
nota: Se è necessario un tempo più lungo per sezionare il tessuto SCZ, immergere i tessuti sezionati in PBS freddo prima di tagliare.
- Risospendere il tessuto tagliato con 1 ml di tampone digestivo, trasferire il tessuto in una provetta da 15 ml contenente 2 ml di tampone digestivo e incubarlo per 30 minuti in un bagno d'acqua a 37°C.
nota: Agitare il tubo ogni 10 minuti per mescolare bene.
3. Coltura di cellule staminali neurali adulte derivate dalla zona subcallosa
- Picchiettare delicatamente la provetta per dissociare il tessuto digerito, quindi centrifugare la provetta a 145 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, sospendere nuovamente il tessuto digerito con 1 mL di terreno N2 preriscaldato per lavare via il tampone digestivo e pipettare delicatamente la soluzione del campione per un massimo di 5 volte utilizzando una pipetta P1000.
nota: L'eccessiva triturazione con una punta di pipetta stretta può ridurre la vitalità cellulare e la successiva crescita.
- Centrifugare la provetta a 145 x g per 5 min. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno N2.
- Preparare 1 ml di terreno N2 in una piastra a 6 pozzetti non rivestita e aggiungere 1 ml di cellule sospese per ottenere un volume finale di 2 ml.
- Aggiungere EGF (20 ng/ml) e bFGF (20 ng/ml) in ciascun pozzetto. Agitare delicatamente a mano la piastra di coltura a 6 pozzetti per mescolare i fattori di crescita aggiunti con le cellule piastre. Conservare la piastra a 6 pozzetti in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
- Aggiungere EGF (20 ng/ml) e bFGF (20 ng/ml) a ciascun pozzetto ogni giorno per 8 giorni. Ogni tre giorni, aggiungere 200 μl di terreno N2 per mantenere il volume di circa 2 ml del terreno.
4. Passaggio di NSC come neurosfere e in colture monostrato
- Raccogliere le neurosfere e trasferirle in un nuovo tubo conico da 15 ml.
Nota: Il numero di neurosfere (>50 μm di diametro) per pozzetto dalla SCZ di un singolo cervello di topo era 64,3 ± 7,31, che era inferiore a quello della SVZ (190,5 ± 6,33).
- Incubare le neurosfere con 0,5 ml di tampone di dissociazione per 5 minuti in un bagno d'acqua a 37°C per dissociare le neurosfere in singole cellule. Le neurosfere primarie possono essere dissociate in singole cellule e mantenute in diversi passaggi come neurosfere o colture monostrato.
nota: L'espansione delle SCZ-aNSC come monostrato è superiore a quella delle neurosfere, perché le SCZ-aNSC possono essere passate >10 volte in un formato di coltura monostrato, ma <5 volte in un formato di coltura a neurosfera.
cautela: Le SCZ-aNSC mostrano una forte aggregazione ed è difficile dissociarle in singole cellule. Pertanto, il formato di coltura della neurosfera non è raccomandato per l'espansione cellulare di routine.
- Pipettare delicatamente la soluzione del campione su e giù con una pipetta P1000 meno di 5 volte e centrifugare la provetta a 145 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le neurosfere con 1 ml di terreno N2.
nota: L'eccessiva titolazione con una punta di pipetta stretta può ridurre la vitalità cellulare e la successiva crescita.
- Per contare le cellule, preparare una miscela 1:1 della sospensione cellulare (10 μl) e della soluzione di blu di tripano allo 0,4%, quindi contare il numero di cellule vive su un ematocitometro. Dopo aver rivestito una piastra a 6 pozzetti con PLO/laminina, piastrate le cellule a 2,5 x 105 cellule/ml con 2 ml di terreno N2 per ogni pozzetto.
nota: I cambiamenti nella densità cellulare possono influenzare la loro condizione e il potenziale di differenziazione.
- Mantenere le SCZ-aNSCs con un trattamento quotidiano di fattori di crescita (2 ml, 20 ng/ml) per 5 giorni, quindi farle passare.
5. Differenziazione di cellule staminali neurali adulte derivate dalla zona subcallosa
- Piastra le aNSC su un vetrino coprioggetti da 18 mm rivestito di PLO/Laminina con 1 x 105 cellule/ml in 1 ml di N2 con fattori di crescita (20 ng/ml) per la differenziazione delle SCZ-aNSC.
- Il giorno successivo, quando le cellule sono saldamente attaccate al vetrino, scambiare il terreno di coltura con N2 per rimuovere i fattori di crescita.
- Dopo 6 giorni, lavare le cellule differenziate con 1 ml di PBS per rimuovere i detriti cellulari e fissarle per l'immunocolorazione.
Nota: BrdU può essere incorporato nel DNA appena sintetizzato delle cellule proliferanti. Pertanto, se lo si desidera, BrdU (10 μg/ml) può essere aggiunto alle cellule vive prima della fissazione delle cellule.
